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1.一种快速、灵敏检测甲肝减毒活疫苗病毒感染性滴度的方法，其特征在于包括下列步骤：A、病毒培养将KMB17细胞植入小方瓶中，培养至长成新鲜单层后，将甲肝减毒活疫苗样品作10倍系列稀释，取稀释度为10-4-10-9的病毒液接种至该细胞单层上，吸附1～2小时后，补加维持液，于35-37℃培养5-8天；B、提取细胞内甲肝病毒基因组正链RNA；C、引物设计正向引物N1：5’-TTGGGATTAGCGAGTATG-GGATGTTTCAGGAGTACAAGC-3’反向引物N2：5’-GACCTGGATAGGCTGTGTGAT-CTCTGATTGTTCTGTGACAGAC-3’正向引物M1：5’-TTGGGATTAGCGAGTATG-3’反向引物M2：5’-GACCTGGATAGGCTGTGTGAT-3’正向引物N3：5’-ATTACAGGAGCAACTGATGTAG-3’；D、检测甲肝病毒负链RNA中间体a、逆转录反应在离心管中依次加入下列试剂：10×逆转录缓冲液 2.5～5.0μl浓度为2.5～10mmol/L的dNTP混合物 1.25～10μl浓度为5～60μmol/L的正向引物N1 1.0～5μl浓度为40u/μl的RNase抑制剂 1.0～2.0μl浓度为4u/μl的逆转录酶 1.0～2.0μl甲肝病毒RNA 15.0～30.0μl无核酸酶水 补充至总反应体积25～50μl在37～42℃下反应90～120分钟；将所获逆转录反应产物煮沸45～75分钟；b、第一轮聚合酶链式反应在离心管中依次加入下列试剂：10×PCR缓冲液 10.0～15.0μl浓度为2.5～10mmol/L的dNTP混合物 2.0～8.0μl浓度为5～60μmol/L的反向引物N2 1.0～5.0μl浓度为5～60μmol/L的正向引物M1 1.0～5.0μl浓度为5u/μl的DNA聚合酶 0.5～1.0μl逆转录反应产物 10.0～15.0μl无核酸酶水 补充至总反应体积100～150μl在94℃预热20～30分钟，之后在94℃变性1～2分钟，在52～55℃退火1～2分钟，在72℃延伸1.5～2分钟，如此循环30～35次后，再在72℃延伸20分钟，得第一轮聚合酶链式PCR反应产物；c、第二轮聚合酶链式反应在离心管中依次加入下列试剂：10×PCR缓冲液 5.0～7.5μl浓度为2.5～10mmol/L的dNTP混合物 1.0～4.0μl浓度为5～60μmol/L的引物N3 0.5～2.5μl浓度为5～60μmol/L的引物M2 0.5～2.5μl浓度为5u/μl的DNA聚合酶 0.25～0.5μl稀释1～10倍的第一轮PCR产物 1.0～2.0μl无核酸酶水 补充至总反应体积50～75μl在94℃预热20～30分钟，之后在94℃变性1～2分钟，在52～55℃退火1～2分钟，在72℃延伸1.5～2分钟，如此循环30～35次后；再在72℃延伸20分钟，得第二轮聚合酶链式PCR反应产物；E、电泳分析和滴度计算用1.5％浓度琼脂糖凝胶对第二轮聚合酶链式反应PCR产物进行电泳分析，出现351bp长度的DNA特异性条带者为阳性结果，用Reed-Muench公式计算出滴度。 |
