添加扩增内标的单核细胞增生李斯特菌PCR检测方法

摘要

本发明涉及的是一种生物技术领域用于食品安全的添加扩增内标的单核细胞增生李斯特菌PCR检测方法。包括以下步骤：人工合成一段扩增内标序列，设计对应的特异引物；通过对MgCl₂浓度和退火温度Tm值进行优化选择；进行PCR检测、对照，选择对检测灵敏度影响最小且能够明确指示假阴性的扩增内标的浓度作为添加浓度；确定引物的特异性及扩增内标在非单核细胞增生李斯特菌样品检测中是否能够正常扩增；通过抗干扰实验判断PCR检测体系的稳定性，通过检测人工污染样品判断扩增内标是否指示假阴性，以此来评价建立的PCR检测体系的检测结果是否准确。本发明提高PCR检测的准确率，为满足检疫执法过程中所急需的对食源性致病菌调查和检测提供有效可靠的技术手段。

主权项

1.一种添加扩增内标的单核细胞增生李斯特菌PCR检测方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)人工合成一段扩增内标序列，设计对应的特异引物；(2)通过对MgCl2浓度和退火温度Tm值进行优化选择；(3)首先经过测定的单核细胞增生李斯特菌总DNA溶液用无菌水作10倍梯度稀释至10-8，以稀释的DNA溶液为模板，进行PCR检测，同时以金黄色葡萄球菌标准株DNA模板作阴性对照，以无菌水代替DNA模板作空白对照，然后，取带有扩增内标的载体，检测DNA或菌株的灵敏度，选择对检测灵敏度影响最小且能够明确指示假阴性的扩增内标的浓度作为添加浓度；(4)提取不同血清型的单核细胞增生李斯特菌和不同种属的非单核细胞增生李斯特菌菌株的DNA，进行PCR检测，确定引物的特异性及扩增内标在非单核细胞增生李斯特菌样品检测中是否能够正常扩增；(5)通过抗干扰实验和人工污染实验对所建立的PCR反应体系进行评价：通过抗干扰实验判断PCR检测体系的稳定性，通过检测人工污染样品判断扩增内标是否指示假阴性，以此来评价建立的PCR检测体系的检测结果是否准确。