丙型肝炎病毒RNA依赖的RNA聚合酶体外活性测定方法及应用

摘要

本发明丙型肝炎病毒RNA依赖的RNA聚合酶体外活性测定方法及应用涉及的是建立丙型肝炎病毒RNA依赖的RNA聚合酶(NS5B蛋白)活性体外测定的安全、实用的方法、应用涉及基因工程技术、纳米磁分离富集和RNA相关技术领域。本发明利用基因工程技术表达纯化可溶性的NS5B蛋白，并制备磁性纳米颗粒。将RNA模板一端固定在磁性纳米颗粒上，加入96孔反应板微孔内，再加入NS5B蛋白等构成RNA复制体系，在磁性纳米颗粒上复制的RNA双链，掺入标记了生物素。RNA复制后，用外磁场磁铁将磁性纳米颗粒吸附在微孔底部，反复洗涤吸附后与辣根过氧化物酶标记的亲和素结合，吸附洗涤后，加入辣根过氧化物酶的底物显色。利用建立的方法，可从中药库及化合物库内筛选新的NS5B蛋白酶活性抑制剂。

主权项

1.一种丙型肝炎病毒RNA依赖的RNA酶聚合酶活性测定的方法，其特征在于：(1).NS5B片段的PCR扩增：利用PCR技术扩增C端截短21个氨基酸的HCV NS5B基因片断；(2).表达HCV NS5B-C21蛋白片段重组质粒的构建：提取质粒pET28a(+)，用Bam HI和XhoI双酶切，电泳后回收酶切的质粒大片段，溶于去离子水内，同样用BamH I和XhoI双酶切PCR扩增的NS5B-C21蛋白基因片段，电泳回收后，溶于去离子水内；取等摩尔浓度的上述两种酶切后DNA片段，在同一离心管内用T4 DNA连接酶连接，使NS5B蛋白基因片段插入到载体pET28a(+)内的BamH I和Xho I位点之间，与载体上的起始密码子翻译框架一致，表达一个融合蛋白；(3).重组质粒和表达融合蛋白工程菌的筛选与鉴定：将重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)，涂布含卡那霉素浓度为60μg/ml的LB平板，置37℃过夜；次日随机挑取转化菌落和一个对照菌，对照菌为质粒pET28a转化菌，诱导表达的目的蛋白，收集菌体进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，重组子表达相对分子量约为65 kD的HCV NS5B-C21蛋白，而对照菌BL21(DE3)无此蛋白带；将筛选出的阳性克隆表达菌提取质粒进行PCR扩增鉴定和酶切鉴定，鉴定正确的质粒进行测序，测序结果完全正确；(4).表达的NS5B-C21蛋白的纯化：1)表达NS5B蛋白工程菌的超声裂解将诱导表达融合蛋白的工程菌离心收菌，菌体重悬于裂解液内，冰浴超声破菌，离心收集上清，弃沉淀，收集的上清液用于下一步的亲和纯化；2)镍琼脂糖凝胶亲和层析法纯化将镍琼脂糖凝胶亲和层析柱连接至常压层析系统，先用平衡液冲洗平衡，细菌超声裂解上清液加镍琼脂糖凝胶凝胶室温结合，上柱后收集穿过峰。用结合缓冲液洗涤柱子，接着用分别含100mM、200mM、300mM、500mM咪唑的洗脱缓冲液洗脱目的蛋白，十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳检测目的蛋白；(5).纯化的NS5B蛋白用作抗原检测HCV抗体：将纯化的HCV NS5B蛋白用50 mmol/L的碳酸盐pH9.6倍比稀释后包被酶联板，间接酶联免疫法检测已知的抗丙肝病人阳性血清及正常人血清，NS5B-C21蛋白能与丙肝病人阳性血清反应，不与正常人血清反应，说明NS5B-C21蛋白有较好抗原性和特异性；(6).磁性纳米复合颗粒修饰首先，液相载体可采用磁性纳米颗粒，将之加入乙醇/水的比例为199/1混合溶液中，为了更好地分散该颗粒，需将该溶液进一步超声；然后，将氨基硅烷化试剂滴加到以上混合溶液，并在室温下搅拌；最后，利用外加磁场将氨基硅烷化试剂修饰的磁性颗粒从反应介质中分离出，并用乙醇溶液对其清洗；在修饰完之后，将以上颗粒加入到含3％戊二醛的PB溶液中，并在37℃下搅拌3小时；该过程中通过氨基与醛基之间形成的Schiff碱在磁性颗粒表面修饰上醛基官能团；反应结束后，利用外加磁场将颗粒从反应介质中分离出，并用PB溶液反复清洗产物；(7).丙型肝炎RNA依赖的RNA聚合酶活性测定方法的建立化学合成RNA模板，并在其5’端进行氨基修饰，合成两种RNA模板，一个为RdRp酶活性测定通用的poly(A)，长度为20个A，该序列为5′NH2---AAAAAAAAAAAAAAAAAAAA---3′；另一个为HCV RNA的3′端的一段特异序列，该序列为5′NH2---CTTGGCGTAATCATGGTCAT---3′；将RNA模板修饰固定在核壳结构复合磁性纳米颗粒上并加入磁分离微孔反应板微孔内，再加入引物、纯化的RdRp酶，核糖核酸，生物素标记的11位尿苷三磷酸，构成RNA复制反应体系；通过掺入生物素标记单体，利用NS5B蛋白的RNA依赖的RNA聚合酶的活性，使另一条RNA链得到延伸，在外磁场下分离除去非特异性吸附片段，再与酶标记的亲和素结合，洗涤后，向微孔内加入底物显色剂显色；同时用磁铁吸附后将显色液转移到96孔酶联板内，用酶联仪测定各孔的A450吸光值；(8).从中药样品库和小分子化合物库内筛选新的NS5B蛋白酶活性抑制剂用96孔或384孔微孔反应板，每个微孔内加入结合有Poly(A)RNA模板的纳米磁性颗粒，每个微孔内都形成一个相同的NS5B蛋白酶活性测定体系，在向反应体系内加入NS5B蛋白酶之前，先向各孔分别加入不同的待筛选抑制剂，同时设立已知NS5B蛋白酶活性特异性抑制剂阳性对照孔，通过各孔的显色情况即可判定结果，同时用磁铁吸附后将显色液转移到96孔酶联板内，用酶联仪测定各孔的A450吸光值；对筛选到的阳性抑制剂，更换RNA模板，用HCV RNA的3’端一段特异RNA作为模板，再进行抑制试验。