一种真盐生植物细胞质膜水通道蛋白基因的应用

摘要

本发明公开了一种真盐生植物(Euhalophyte)细胞质膜水通道蛋白基因的应用，属于基因工程领域。海蓬子(Salicornia bigeloii Torr.)细胞质膜水通道蛋白基因SbPIP1 cDNA序列SEQ ID NO.1及其编码的氨基酸序列SEQ ID NO.2。本发明基因为该属植物和真盐生植物中首次报道，参与正常和渗透胁迫下的水分吸收及运输，mRNA表达分析表明该基因受高盐和干旱的诱导。转基因实验证明该基因的超量表达促进了烟草生长并提高了其耐旱和耐盐性。SbPIP1可作为目的基因导入植物，提高植物耐盐或耐旱性。

主权项

1.一种真盐生植物细胞质膜水通道蛋白基因的应用，包括：1)总RNA的提取和cDNA的合成选用发芽后20天的海蓬子幼苗为材料，用200M NaCl处理24h、48h和72h后的植株为Tester材料，以无NaCl处理的材料为Dirver，分别收取各处理的整株幼苗300mg，在液氨下研磨放入7ml离心管，加入3ml Trizol RNA分离试剂盒分离液，室温静置10分钟，11000g4℃离心15分钟，收集上清液，分别用异丙醇和75％己醇沉淀和洗涤RNA，用甲醛变性胶电泳鉴定总RNA质量，用紫外分光光度计测定RNA含量；以5μg总RNA为模板利用1μl反转录酶MMLV42℃50分钟合成单链cDNA；2)植物表达载体的构建根据SbPIP1基因的全长序列，见SEQ ID NO.1，设计扩增出完整编码阅读框的引物，并在上游和下游引物上分别引入限制性内切酶位点BamH和SacI，设计引物为：上游引物：5’-CTCAAGCTTTCAGTGACTG-3’下游引物：5’-GATATGGATTACCTCGAAG-3’以步骤1)中获得的单链cDNA为模板，经PCR扩增后获得可用于转化载体构建的SbPIP1基因，将SbPIP1克隆至中间载体pGEM-T，进一步克隆到双元表达载体pBI121，在保证阅读框架正确的前提下鉴定表达载体；3)转基因植株的获得将步骤2)获得的表达载体转入农杆菌，进一步转入烟草，对获得的转基因植株进行PCR，Southern杂交以及RT-PCR验证后进行植物的耐盐性评价，在1.0％NaCl处理3天后能够在正常生长条件下恢复的T2代转基因烟草植株即为所获得的转基因植株。