发明名称 |
用于T-A克隆的T载体制备方法 |
摘要 |
本发明公开了用于T-A克隆的T载体制备方法,选择一个高拷贝数的常用质粒,以此质粒为模板设计四对引物,通过定点突变构建两种在特定序列有差异的突变质粒;在两种突变质粒的多克隆位点处分别构建TTTTAAA及TTTAAAA序列盒,并分别引入两个不同的酶切位点BamHI和HindIII;将突变质粒分别导入细菌扩增,并将扩增的等量质粒用可识别TTTAAA序列的内切酶切割,混合、变性、复性,反应后的混合物酶切,去除亲本分子,即可分离出T载体。本发明采用独特的生物合成技术生产T载体,这种由生物合成的天然T载体,具有合成方便,生产成本低,克隆效率高,质量稳定等特点,用本方法构建的T载体完成了多个基因的克隆,结果表明其重组效率达到了90%以上。 |
申请公布号 |
CN100383248C |
申请公布日期 |
2008.04.23 |
申请号 |
CN200510123112.7 |
申请日期 |
2005.12.15 |
申请人 |
南京大学 |
发明人 |
田大成;张远莉;王强;金欣庆;丁静 |
分类号 |
C12N15/63(2006.01);C12N15/66(2006.01) |
主分类号 |
C12N15/63(2006.01) |
代理机构 |
南京天翼专利代理有限责任公司 |
代理人 |
汤志武;王鹏翔 |
主权项 |
1.用于T-A克隆的T载体制备方法,其特征在于:(1)选用高拷贝数的常用质粒,以此质粒为模板,设计四对引物,通过定点突变构建两种在特定序列有差异的突变质粒;在两种突变质粒的多克隆位点处分别构建TTTTAAA及TTTAAAA序列盒,并在距离TTTTAAA及TTTAAAA序列盒位点大于200bp的位置,分别引入两个不同的酶切位点BamHI和HindIII;(2)将两种突变质粒分别导入细菌扩增,并将扩增的等量两种突变质粒用可识别TTTAAA序列的内切酶切割,形成两种线性质粒;(3)将酶切后的两种质粒纯化,然后混合、变性、复性杂交,产生四种分子,其中有两种为亲本分子,另两种为新的杂合分子;这两种杂合分子在原来BamHI和HindIII酶切位点处存在不配对区域,即BamHI和HindIII酶切位点被破坏,其中一种杂合分子在其3′端形成具有单个T突出的线性载体;(4)用BamHI和HindIII两种限制性内切酶切割混合质粒;(5)酶切后的混合物进行分离,去除两种亲本分子,分离出两种杂合分子,其中具有单个T突出的线性载体杂合分子是用于T-A克隆的T载体。 |
地址 |
210093江苏省南京市汉口路22号 |