H5、H7、H9亚型禽流感病毒的实时荧光定量PCR检测方法

摘要

一种H5、H7、H9亚型禽流感病毒的实时荧光定量PCR检测方法，属于生物工程技术领域。本发明包括如下步骤：标准分子的构建；病毒特异性定量PCR引物和探针设计；病毒样本RNA的提取；对提取的样本RNA进行反转录聚合酶链式反应得到样本cDNA；M基因定量PCR检测方法的优化和建立；禽流感病毒亚型特异性定量PCR检测方法的优化和建立。本发明检测灵敏度达到20个拷贝的病毒分子，对于单个样本检测时间为2个小时，操作简便，并且可以同时进行大批量的样本分析，较传统的利用鸡胚进行病毒分离培养的方法在灵敏度和检测时间方面有了极大的提高，对于禽流感病毒的监控、鉴定具有很大的帮助和很高的应用前景。

主权项

1.一种H5、H7、H9亚型禽流感病毒的实时荧光定量PCR检测方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)标准分子的构建，在基因库中检索获得禽流感病毒的保守基因，M基因以及H5、H7、H9亚型特异性基因，HA基因的序列，通过网上序列比对，确定禽流感病毒共有基因M以及H5、H7、H9亚型特异性基因HA的高度保守序列区，根据确定的保守序列区设计引物，利用基因克隆技术构建同时含有禽流感病毒共有基因M以及H5、H7、H9亚型特异性基因HA的高度保守序列区的标准质粒分子；(2)病毒特异性定量PCR引物和探针设计；(3)病毒样本RNA的提取；(4)对提取的样本RNA进行反转录聚合酶链式反应得到样本cDNA；(5)M基因定量PCR检测方法的优化和建立，通过100-1000nM范围内各个浓度的引物和探针的组合，寻找所要求的反应效率和曲线的反应体系；(6)禽流感病毒亚型特异性定量PCR检测方法的优化和建立，通过100-1000nM范围内各个浓度的引物和探针的组合，寻找所要求的反应效率和曲线的反应体系。