| 主权项 |
1.一种用以放射标志嵌合物-共轭之抗-CD20抗体之 方法,其包括: (i)混合嵌合物-共轭之抗体与含有放射标志之溶液 ; (ii)培育混合物相对短的时间,在适合温度及pH下以 藉此于少于10分钟下产生具大于95%放射并入( radioincorporation)之经放射标志抗体,且于该适合温 度及pH产生的经放射标志抗体具有足够比活性及 大于70%免疫反应性,因此该经放射标志抗体可直接 投予至病人而毋需进一步将放射标志抗体自未并 入放射标志者中纯化;及 (iii)将经标志之抗-CD20抗体稀释于调和缓冲液至适 合浓度,以供投予至病人而毋需进一步将放射标志 抗体自未并入放射标志者中纯化。 2.根据申请专利范围第1项之方法,其中的嵌合物选 自:MX-DTPA,苯基-DTPA,基-DTPA,CHX-DTPA及DOTA所组成之 群。 3.根据申请专利范围第2项之方法,其中的嵌合物是 MX-DTPA。 4.根据申请专利范围第1项之方法,其中该含放射标 志溶液于与嵌合物-共轭之抗体混合前,系经调整 至约3至6之pH値。 5.根据申请专利范围第4项之方法,其中该pH値系以 低金属醋酸钠溶液调整。 6.根据申请专利范围第5项之方法,其中醋酸钠溶液 浓度为约10至1000 mM。 7.根据申请专利范围第1项之方法,其中的抗体是嵌 合的抗-CD20抗体。 8.根据申请专利范围第1项之方法,其中的抗-CD20抗 体是2B8-MX-DTPA。 9.根据申请专利范围第1项之方法,其中的抗-CD20抗 体系2B8;嵌合物为MX-DTPA;且放射标志为90Y。 10.根据申请专利范围第1项之方法,其中该调配缓 冲液系含生理食盐水、放射保护剂、及未共轭之 嵌合物。 11.根据申请专利范围第10项之方法,其中的放射保 护剂选自:人类血清白蛋白(HSA),抗坏血酸盐,抗坏 血酸,酚,亚硫酸盐,榖胱甘,半胱胺酸,龙胆酸,菸 硷酸,棕榈酸抗坏血酸盐,HOP(:O)H2,甘油,甲醛次硫酸 钠,Na2S2O5,Na2S2O3,及SO2所组成之群。 12.根据申请专利范围第10项之方法,其中未共轭的 嵌合物是DTPA或EDTA。 13.根据申请专利范围第1项之方法,其中的放射标 志是111In氯化物。 14.根据申请专利范围第13项之方法,其中该111In氯 化物抗体之比活性为2至3毫居里/毫克抗体。 15.根据申请专利范围第13项之方法,其中111In氯化 物之体积用量是约4-6毫居里除以标志时之放射活 性浓度。 16.根据申请专利范围第13项之方法,其中约1毫升且 浓度约0.5-30毫克/毫升之嵌合物-共轭的抗体与放 射标志溶液混合。 17.根据申请专利范围第13项之方法,其中的混合物 培育于约30秒及60分钟之间。 18.根据申请专利范围第17项之方法,其中的混合物 培育于15至45分钟之间。 19.根据申请专利范围第13项之方法,其中调和缓冲 溶液加入量为达到约10毫升至约50毫升最终总体积 所必要之量。 20.根据申请专利范围第1项之方法,其中的放射标 志是90Y氯化物。 21.根据申请专利范围第20项之方法,其中该90Y-标志 抗体之比活性为10至15毫居里/毫克抗体。 22.根据申请专利范围第20项之方法,其中90Y氯化物 体积用量为介于约5及100毫居里之间,除以标志时 之放射活性浓度。 23.根据申请专利范围第22项之方法,其中90Y氯化物 之体积用量是约45毫居里除以标志时之放射活性 浓度。 24.根据申请专利范围第20项之方法,其中约1至2毫 升浓度约0.5至30毫克/毫升之MX-DTPA-共轭之抗体与 放射标志溶液混合。 25.根据申请专利范围第24项之方法,其中混合物培 育的时间在约30秒及60分钟之间。 26.根据申请专利范围第25项之方法,其中该混合物 培育的时间在约3及10分钟之间。 27.根据申请专利范围第20项之方法,其中调和缓冲 溶液加入量为达到约10毫升至约50毫升最终总体积 所必要之量。 28.根据申请专利范围第1项之方法,其中该经放射 标志之抗-CD20抗体之免疫反应性系表示为与其标 的细胞结合之经放射标志抗体的百分率,而于结合 分析法中决定,此分析方法包括: (i)混合及培育至少一份经放射标志之抗-CD20抗体 与至少一份CD20-阳性细胞; (ii)混合及培育至少一份经放射标志抗体,与(i)步 骤之一份相同,与至少一份稀释缓冲溶液,其体积 和(i)步骤之CD20-阳性细胞的一份相同,以作为对照 组; (iii)细胞以离心使成团块; (iv)侦测在成团块细胞上清液及对照组中之放射活 性;及 (v)将在细胞上清液中之放射活性量,与在对照组中 之放射活性量比较。 29.根据申请专利范围第28项之方法,其中该放射标 志为90Y。 30.根据申请专利范围第28项之方法,其中该抗-CD20 抗体是2B8。 31.根据申请专利范围第30项之方法,其中该嵌合物 为DTPA。 32.根据申请专利范围第28项之方法,其中该抗体是 嵌合的抗-CD20抗体。 33.根据申请专利范围第28项之方法,其中该CD20阳性 细胞是SB细胞(ATCC # CCL 120)。 34.根据申请专利范围第28项之方法,其进一步包括 (i)混合至少一份的经放射标志抗体与至少一份的 CD20-阴性细胞; (ii)将CD20-阴性细胞以离心使成团块; (iv)侦测在CD20-阴性之成团块细胞上清液中之放射 活性;及 (v)比较在CD20-阴性细胞上清液中之放射活性量与 在CD20-阳性细胞上清液及对照组中之放射活性量 。 35.根据申请专利范围第34项之方法,其中该放射标 志为90Y。 36.根据申请专利范围第35项之方法,其中该嵌合物 为DTPA。 37.根据申请专利范围第34项之方法,其中该CD20-阴 性细胞是HSB细胞(ATCC # CCL 120.1)。 38.根据申请专利范围第1项之方法,其中该经放射 标志抗体之免疫反应性系表示为与其标的细胞结 合之经放射标志抗体的结合百分率,而于结合分析 方法中决定此分析方法包括: (i)混合至少一份经放射标志之抗体与至少一份CD20 -阳性细胞; (ii)混合至少一份放射标志抗体,和(i)步骤的一份 相同,与至少一份稀释缓冲溶液,其体积和(i)步骤 之CD20-阳性细胞相同,以作为对照组; (iii)将细胞以离心使成团块; (iv)侦测在成团块细胞上清液及对照组中之放射活 性;及 (v)比较在细胞上清液中之放射活性量与在对照组 中之放射活性量; 其中该分析系使用含有如下成份之套组来进行: (i)至少一个含固定的或冷冻乾燥之CD20-阳性细胞 之小瓶; (ii)一个含有嵌合物-共轭之抗-CD20抗体之小瓶; (iii)一个含有调和缓冲溶液之小瓶;及 (iv)放射标志抗体用之操作指示, 其中该小瓶组份以此剂量及此浓度供应下,当依据 套组指示与放射标志组合时,系产生具大于95%放射 并入、足够比活性及大于70免疫反应性之经放射 标志抗体,因此该经放射标志抗体于投予至病人前 勿需自未并入放射标志者中进一步的纯化。 39.根据申请专利范围第38项之方法,其中该放射标 志为90Y。 40.根据申请专利范围第39项之方法,其中该抗体为2 B8。 41.根据申请专利范围第40项之方法,其中该嵌合物 为DTPA。 42.根据申请专利范围第1项之方法,其中该经放射 标志抗体之免疫反应性系表示为与其标的细胞结 合之经放射标志抗体的结合百分率,而于结合分析 方法中决定此分析方法包括: (i)混合至少一份的放射标志抗体与至少一份的CD20 -阳性细胞; (ii)混合至少一份的放射标志抗体,和(i)步骤之一 份相同,与至少一份稀释缓冲溶液,其体积和(i)步 骤之CD20-阳性细胞相同,以作为对照组; (iii)将细胞以离心使成团块; (iv)侦测在成团块细胞上清液及对照组中之放射活 性;及 (v)比较细胞上清液中放射活性之量与对照组之放 射活性量; 其中该分析系利用含有至少一个含经固定或经冷 冻乾燥的CD20-阳性细胞之小瓶、及一含特别结合 至该CD20-阳性细胞之CD20抗原的嵌合物-共轭之抗-CD 20抗体之小瓶的套组来进行。 43.根据申请专利范围第42项之方法,其中该放射标 志为90Y。 44.根据申请专利范围第43项之方法,其中该抗体为2 B8。 45.根据申请专利范围第44项之方法,其中该嵌合物 为DTPA。 46.根据申请专利范围第1项之方法,其中该经放射 标志抗体之免疫反应性系以竞争结合分析来决定, 该方法包括: (i)制备以钌-标志之受试抗-CD20抗体; (ii)于具固定浓度的经固定、新鲜的或经冷冻乾燥 之CD20-阳性细胞及具固定浓度之经钌-标志抗体的 不同管中培育渐增量之受试抗体; (iii)依据相对电化学发光(ECL)决定各反应试管中经 钌-标志抗体结合至细胞之相对量;及 (iv)依据于各反应管中侦测所得结钌-标志抗体结 合至细胞之相对量,计算受试抗体对细胞之亲和力 。 47.根据申请专利范围第46项之方法,其中该抗体为2 B8。 48.根据申请专利范围第46项之方法,其中该CD20-阳 性细胞是SB细胞(ATCC # CCL 120)。 49.根据申请专利范围第9项之方法,其中该90Y-标志 抗体之比活性大于3.2毫居里/毫克抗体。 50.根据申请专利范围第20项之方法,其中该90Y-标志 抗体之比活性大于3.2毫居里/毫克抗体。 图式简单说明: 图1 在放射免疫分析法中利用125I-标志之B1行直接 竞争作用,比较天然2B8与商品化抗-CD20抗体B1(Coulter )及Leu 16(Becton Dickinson)之免疫反应性。在V&P过滤盘 各孔洞中,加入抗原-阳性之SB细胞(100,000 );10毫微 克的经放射标志的B1,与各种浓度之未标志竞争物 混合,混合物再加至细胞中。抗体与细胞在环境温 度下培育1小时;进行三次数値之决定分析。接下 来,孔洞洗涤,乾燥再决定黏附在滤膜上之放射活 性。所示出之数据系经背景放射活性校正过的,且 为三次决定値之平均値。 图2表2B8与存在于人类B-细胞上之CD20抗原结合之 FACS分析。利用FACS分析增量之未共轭2B8与人类B-细 胞(SB)之结合。利用商品化之抗-CD20单株抗体(B1)及 二种不相关的同型抗体进行比较。以山羊抗-老鼠 IgG-FITC F(ab)'2为第二试剂。结果显示,2B8与CD20抗原 具特异性,且其呈现之结合力大于B1。 图3表2B8结合至B-细胞之Scatchard分析。人类B-细胞( SB)与增量的125I-标志的2B8共培育。三组样品培育1 小时,而于过滤收集细胞后决定与细胞结合之放射 活性。Scatchard分析显示4.310-9M表观的亲和力常数 。 图4表以未标记之B1,2B8及MX-DTP共轭之2B8对放射标记 之B1抗-CD20 Mab之抑制作用。天然的2B8,2B8-MX-DTPA及B1 之免疫反应性。B1抗体如上方法一段中所述地放 射标志。10毫微克经放射标志之B1与增量竞争物混 合,再将混合物加至V&P滤盘之孔洞中,其中各孔洞 含有100,000抗原-阳性之SB细胞;所有的决定均进行 三次。在环境温度下培育1小时,再充份洗涤孔洞 。接下来,将滤膜乾燥,再以计数决定相关之放 射活性;所有数値均以背景校正之。所示出之数値 为三次决定之平均値。 图5表在4℃及30℃下培育期间2B8之免疫反应性。抗 体2B8以10毫克/毫升之终浓度调和在生理食盐水或 含有10mM甘胺酸-HCl,pH 6.8之生理食盐水中。样品一 组两份置于有螺盖之小瓶中,小瓶内充入氮气再加 盖。样品再于4℃或30℃下培育12周;每周评估样品 之免疫反应性。在12周之研究中,以任何的2B8样品 未见免疫反应性之丧失。示出第1周(图5A),6周(图5B )及12周(图5C)之免疫反应性。 图6表111In-标记之2B8-MX-DTPA与CD20阳性人类细胞之结 合。以111In-标志之2B8-MX-DTPA与含有50毫克/毫升人 类血清白蛋白(48小时培育)之PBS(pH 7.4)培育后,行结 合分析以决定免疫反应性。图6A),固定量之经放射 标志抗体(5毫微克/毫升)与增量的SB细胞(20106细胞 /毫升)培育。结合至细胞之放射活性量(cpm)对加入 之细胞悬液量作图。图6B)总放射活性对结合之放 射活性(AT/B)作图。线性外插可计算出y-截矩(0.997) 。y-截矩之倒数乘以100可得在不定抗原过量下100% 之免疫反应性数値。 图7表90Y-标记之2B8-MX-DTPA于含有人类血清白蛋白及 DTPA之PBS中之试管内稳定性。经90Y-标志之2B8-MX-DTPA 在4℃下于含有75毫克/毫升人类血清白蛋白及1 mM DTPA之PBS中培育,由SDS-PAGE分析中得放射自显图。在 所指示之时间下,样品在非-还原条件下,变性条件 下(SDS),于4-20% Tris-甘胺酸凝胶上电泳。样品以5微 升(1,2列),10微升(5,6列)填加。凝胶在环境温度下曝 于x-射线底片下约15分钟,并照相。 图8表90Y-标记之2B8-MX-DTPA在含有人类血清白蛋白及 DTPA之PBS中之试管内稳定性。经90Y-标志之2B8-MX-DTPA 在4℃下于PBS中(pH 7.4)(含有75毫克/毫升人类血清白 蛋白及1 mM DTPA)培育后行SDS-PAGE分析,所得之零时放 射自显图再行密度分析。样品利用非还原条件,在 4-20% Tris-甘胺酸凝胶上电泳。样品填加的量是5微 升,10微升及20微升,二个孔洞一组。凝胶在环境温 度下曝于x-射线底片约15分钟,且孔洞之一利用密 度计扫描。经放射标志之共轭物峰(#2)之相对面积 是96.2%。 图9表90Y-标记之2B8-MX-DTPA在含有人类血清白蛋白及 DTPA之PBS中之试管内稳定性。经90Y-标志之2B8-MX-DTPA 在4℃之PBS中培育(含有75毫克/毫升人类血清白蛋 白及1 mM DTPA,pH 7.4),其SDS-PAGE分析后所得之48小时放 射自显图再行密度扫描。样品在非还原条件下,于 4-20% Tris-甘胺酸凝胶上电泳。样品填加量是5微升, 10微升及20微升,每二个孔洞一组。凝胶在环境温 度下曝于x-射线底片下约15分钟,再利用密度计扫 描一列。经放射标志之共轭物峰(#2)相对面积是95. 5%。 图10表111In-标记之2B8-MX-DTPA在含有人类血清白蛋白 之PBS中之试管内稳定性。经111In-标志之2B8-MX-DTPA 在4℃之PBS中(pH 7.4)培育(含有50毫克/毫升人类血清 白蛋白)其SDS-PAGE分析后所得之放射自显图。在所 示时间下,样品利用非还原条件,在4-20% Tris-甘胺酸 凝胶上电泳。样品填加量是5微升(1,2列),10微升(3,4 列)及20微升(5,6列)。凝胶在环境温度下曝于x-射线 底片上约15分钟,再照相。(注:利用加强之遮蔽板 可得48小时放射自显图,可生成较零时放射自显图 更强之讯号)。 图11表111In-标记之2B8-MX-DTPA在含有人类血清白蛋白 之PBS中之试管内稳定性。经111In-标志之2B8-MX-DTPA 在4℃下与PBS(pH 7.4)共培育(含有50毫克/毫升人类血 清白蛋白)其SDS-PAGE分析所得再行零时放射自显图 之密度扫描。样品在非还原条件下,在4-20% Tris-甘 胺酸凝胶上电泳。样品填加量是5微升,10微升及20 微升,每二孔洞一组。凝胶在环境温度下曝于x-射 线底片约15分钟,再以密度计扫描一列。经放射标 志之共轭物峰(#3)之相对面积是95.9 %。 图12表111In-标记之2B8-MX-DTPA在含有人类血清白蛋白 之PBS中之试管内稳定性。经111In-标志之2B8-MX-DTPA, 在4℃下于PBS(pH 7.4)中培育(含有50毫克/毫升人类血 清白蛋白)其SDS-PAGE分析之48小时放射自显图再行 密度扫描。样品在非还原条件下,在4-20% Tris-甘胺 酸凝胶上电泳。样品填加之量是5微升,10微升及20 微升,每二孔洞一组。凝胶在环境温度下曝于x-射 线底片下约15分钟,再以密度计扫描一列。经放射 标志之共轭物峰相对面积是97.0%(#2,3及4峰之组合 面积)。 图13表90Y-标记之2B8-MX-DTPA在人类血清中培育下之 试管内稳定性。经90Y-标志之2B8-MX-DTPA,在37℃之人 类血清中培育,其SDS-PAGE分析所得之放射自显图。 在所示时间下,样品利用非还原条件,在4-20% Tris-甘 胺酸凝胶上电泳。样品填加之量是5微升(1,2列),10 微升(3,4列)及20微升(5,6列)。凝胶在环境温度下曝 于x-射线底片下约15分钟,再照相。 图14表90Y-标记之2B8-MX-DTPA在人类血清中培育下之 试管内稳定性。经90Y-标志之2B8-MX-DTPA,在37℃之人 类血清中培育,其SDS-PAGE分析所得之零时放射自显 图密度扫描。样品在非还原条件下,于4-20% Tris-甘 胺酸凝胶上电泳。样品填加量是5微升,10微升及20 微升,每二孔洞一组。凝胶在环境温度下曝于x-射 线底片约15分钟,再以密度计扫描一列。放射标志 之共轭物峰(#2)之相对面积是97.9%。 图15表90Y-标记之2B8-MX-DTPA在人类血清中培育下之 试管内稳定性。经90Y-标志之2B8-MX-DTPA,在37℃之人 类血清中培育,其SDS-PAGE分析后之98小时放射自显 图再行密度扫描。样品在非还原条件下,于4-20% Tris-甘胺酸凝胶上电泳。样品填加量是5微升,10微 升及20微升,每二孔洞一组。凝胶在环境温度下曝 于x-射线底片下约15分钟,其中一列再利用密度计 扫描。经放射标志共轭物峰(#2)之相对面积是94.7% 。 图16表111In-标记之2B8-M X-DTPA在含有人类血清白蛋 白之PBS中之试管内稳定性。经111In-标志之2B8-MX- DTPA,在37℃之人类血清中培育,其SDS-PAGE分析之放射 自显图。在所指示之时间下,样品利用非还原条件 ,在4-20% Tris-甘胺酸凝胶上电泳。样品填加量是5微 升(1,2列),10微升(3,4列)及20微升(5,6列)。凝胶在环 境温度下曝于x-射线底片下约16-20小时,并照相之 。 图17表111In-标记之2B8-MX-DTPA在含有人类血清白蛋白 之PBS中之试管内稳定性。经111In-标志之2B8-MX-DTPA, 在37℃之人类血清中培育,其SDS-PAGE分析之零时放 射自显图再行密度扫描。样品在非还原条件下,于 4-20% Tris-甘胺酸凝胶上电泳。样品填加量是5微升, 10微升及20微升,每二孔洞一组。凝胶在环境温度 下曝于x-射线底片下约16-20小时,再利用密度计扫 描一列。经放射标志之共轭物峰(#3)之相对面积是 95.3%。 图18表111In-标记之2B8-MX-DTPA在含有人类血清白蛋白 之PBS中之试管内稳定性。经111In-标志之2B8-MX-DTPA, 在37℃之人类血清中培育,其SDS-PAGE分析后之96小时 放射自显图再行密度扫描。样品在非还原条件下, 于4-20% Tris-甘胺酸凝胶上电泳。样品填加量是5微 升,10微升及20微升,每二孔洞一组。凝胶在环境温 度下曝于x-射线底片下约16-20小时,并利用密度计 扫描一列。经放射标志之共轭物峰(#3)之相对面积 是94.0%。 图19表2B8灌注对Cynomolgns猴子B-淋巴细胞水平之影 响,由第0天至第13天。恒河猿每48小时静脉内注射, 共七次注射。示出投予之剂量。利用抗-CD2(T-细胞 ),抗-Mo-IgG(2B8),抗-CD20(Leu 16)及抗-人类IgG(B-细胞),经 由FACS分析决定循环的T-及B-细胞水平。在循环的T- 细胞水平上未见影响。(V组动物给予单一剂量)。 图20表Cynomolgns猴子注入鼠单株抗-CD20抗体2B8循环B 细胞水平之恢复。以FACS分析回收接受2B8动物体内 之循环B-细胞,采用图19简要说明之经萤光标志之 抗体。第III及IV组之动物因为在第13天时牺牲故未 追。 图21表2B8-MX-DTPA对Cynomolgns猴子中循环B细胞之影响 。恒河猿静脉内注入经89Y-2B8-MX-DTPA,其系利用临床 级之2B8-MX-DTPA制备。动物以上示之剂量每48小时给 予,共七剂。在第0,2,7,10及14天时对动物采血,再评 估血清化学血液学及循环的B-细胞水平(第10天未 分析血清中之B-细胞数目)。除了所有动物之总淋 巴球数目降低外,II组中有二个体例外,于整个研究 期间未有显着不正常处。 图22表单一注入10毫克/公斤后2B8自Cynomolgns猴子之 清除率以及2B8,2B8-MX-DTPA自BALB/c老鼠中之血液清除 率。在第零天注入单一剂10毫克/公斤后,以ELISA决 定猴子中鼠类抗-CD20抗体2B8之清除率。如A列中所 示,抗体在约4.5天之t1/2値处呈现。由BALB/c老鼠 循环中之2B8抗体清除率及其MX-DTPA共轭物示于B列 。老鼠静脉内注入25微克天然的或共轭的2B8,而于 注射后再于各种时间点时采血,高达264小时;再以 酵素免疫分析法分析血清,利用SB细胞为捕获剂。 天然的及共轭的抗体均呈现8.75天之清除値。 图23表111In-2B8-MX-DTPA生物分布。20只BALB/c老鼠各注 入1.1 Ci经放射标志之共轭物(100微升),其调和在 PBS中,pH 7.4,含有50毫克/毫升HSA。每组各5只老鼠,在 第1,24,48及72小时时牺牲,再制备及分析血液及各种 组织相关之放射活性。 图24表90Y-2B8-MX-DTPA生物分布。20只BALB/c老鼠各静脉 内注入约1.0 Ci(于100微升中)经放射标志之共轭 物,其调和于1PBS中,pH 7.4,其中含有75毫克/毫升人 类血清白蛋白及1 mM MDPA。每组各五只老鼠,于第1, 24,48及72小时时牺牲,再制备及分析其其血液及各 种组织相关之放射活性。 图25表111In-2B8-MX-DTPA肿瘤定位。有Ramos B-细胞肿瘤 之无胸腺老鼠,静脉内注入24 Ci 111In-2B8-MX-DTPA,且 每组3只老鼠于0,24,48及72小时时牺牲。在准备组织 并决定相关之放射活性后,决定每克组织中注入剂 量百分率,并如所示地画图。 图26表90Y-标记之2B8-MX-DTPA与CD20阳性人类细胞之结 合。以结合分析法来决定"混合及扫射"之90Y-经标 志之2B8-MX-DTPA之免疫反应性,其培育在含有50-75毫 克/毫升人类血清白蛋白之PBS中(pH 7.4)(48小时的培 育)。A)列:固定量之90Y-标志之抗体(约1毫微克/毫 升)与增量的SB细胞培育。结合至细胞之放射活性( cpm)对细胞浓度作图。B)列:施加之总90Y放射活性对 结合之放射活性(AT/B)作图。线性外插可估算出y- 截矩(1.139)。在不定的抗原过量下,y-截矩倒数乘以 100可得87.9%之免疫反应性数値。以CD20-阴性细胞( HSB)未观察到结合。 图27表90Y-标记之2B8-MX-DTPA于含有人类血清白蛋白 及DTPA之PBS中之试管内稳定性。经90Y-标志之2B8-MX- DTPA培育在4℃之PBS中,pH 7.4并含有75毫克/毫升人类 血清白蛋白及1 mM DTPA,其SDS-PAGE分析后之放射自显 图。在所示时间下,样品在非还原变性(SDS)条件下, 于4-20% Tris-甘胺酸凝胶上电泳。样品填加量为5微 升(1,2列),10微升(5,6列)。凝胶在环境温度下曝于x- 射线底片下约15分钟,再照相。 图28表90Y-标记之2B8-MX-DTPA在含有人类血清白蛋白 及DTPA之PBS中之试管内稳定性。经90Y-标志之2B8-MX- DTPA在4℃之PBS中培育,pH 7.4并含有75毫克/毫升人类 血清白蛋白及1 mM DTPA,其SDS-PAGE分析所得的零时放 射自显图再行密度扫描。样品在非还原条件下,于 4-20% Tris-甘胺酸凝胶上电泳。样品填加量为5微升, 10微升及20微升,每二个孔洞一组。凝胶在环境温 度下曝于x-射线底片下约15分钟,再以密度计扫描 一列。经放射标志之共轭物峰(#2)之相对面积是96. 1%。 图29表90Y-标记之2B8-MX-DTPA在含有人类血清白蛋白 及DTPA之PBS中之试管内稳定性。经90Y-标志之2B8-MX- DTPA在4℃之PBS中培育,pH 7.4并含有75毫克/毫升人类 血清白蛋白及1mM DTPA,其SDS-PAGE分析所得之48小时放 射自显图再行密度扫描。样品在非还原条件下,于 4-20% Tris-甘胺酸凝胶上电泳。样品填加量是5微升, 10微升及20微升,每二个孔洞一组。凝胶在环境温 度下曝于x-射线底片下约15分钟,再以密度计扫描 一列。经放射标志之共轭物峰(#2)之相对面积是94. 1 %。 图30表90Y-标记之2B8-MX-DTPA在人类血清培育下之试 管内稳定性。"混合&扫描"90Y-标志之2B8-MX-DTPA在37 ℃之人类血清中培育,其SDS-PAGE分析所得之放射自 显图。在所示之时间点下,样品在非还原条件下, 于4-20% Tris-甘胺酸凝胶上电泳。样品填加量为5微 升(1,2列),10微升(3,4列)及20微升(5,6列)。凝胶在环 境温度下曝于x-射线底片下约15分钟,再照相。 图31表90Y-标记之2B8-MX-DTPA在人类血清培育下之试 管内稳定性。"混合&扫射"90Y-标志之2B8-MX-DTPA培育 在37℃之人类血清中,其SDS-PAGE分析所得之零时放 射自显图再行密度扫描。样品利用非还原条件下, 于4-20% Tris-甘胺酸凝胶上电泳。样品填加量是5微 升,10微升及20微升,每二个孔洞一组。凝胶在环境 温度下曝于x-射线底片下约15分钟,其中一列再以 密度计扫描。放射标志之共轭物峰(#2)之相对面积 是89.1 %。 图32表90Y-标记之2B8-MX-DTPA在人类血清培育下之试 管内稳定性。"混合&扫射"90Y-标志之2B8-MX-DTPA培育 在37℃之人类血清中,其SDS-PAGE分析所得之72小时放 射自显图再行密度扫描。样品在非还原条件下,利 用4-20% Tris-甘胺酸凝胶电泳。样品填加量是5微升, 10微升及20微升,每二个孔洞一组。凝胶在环境温 度下曝于x-射线底片下约15分钟,其中一列再以密 度计扫描。经放射标志之共轭物峰(#2)之相对面积 是88.8%。 图33表90Y-标记之2B8-MX-DTPA在老鼠之生物分布。20只 BALB/c老鼠以5 Ci 90Y-标志之2B8-MX-DTPA(调和在1PBS, pH 7.4,含有75毫克/毫升人类血清白蛋白及1 mM DTPA) 静脉内注射。每组5只,各自在1、24、48及72小时时 牺牲,再准备及分析其血样及各种组织相关之放射 活性。 图34表CHO-衍生之2B8与CD20-阳性及CD20-阴性人类细胞 之直接结合。增量之CHO-衍生之2B8抗体,与固定浓 度之新鲜收获之CD20-阳性B-细胞(SB)或CD20-阴性之T- 细胞(HSB)共培育。利用FACS分析定量与细胞结合之 抗体,并使用如此中所述之山羊抗-老鼠IgG-FITC F(ab) '2。以不相关之同型抗体(S004)作比较。仅CHO-衍生 之2B8抗体,可显示与CD20-阳性SB细胞有任何感知之 结合。 图35表CHO-衍生之2B8对CD20-阳性人类细胞之竞争性 结合。CHO-衍生之2B8与在融合瘤细胞株产生之2B8-49 亲代抗体,利用ORIGEN分析中之直接竞争比较其免疫 反应性。增量之抗体与固定浓度之CD20-阳性B-细胞 (SB)及痕量的以钌-标志之CHO 2B8共培育。经过在环 境温度下培育3小时后,利用材料及方法一段中所 述之ORIGEN仪器来决定以相对电化萤光(ECL)表示之 结合。所示出之数値代表二次决定値之平均。CHO 2B8及2B8-49之平均亲和力常数经估算分析是1.310-10M 及2.510-10M。在比较中包括一个不相关之同型抗体 (S004)。 图36表CHO-衍生之2B8与2B8-MX-DTPA对CD20-阳性人类细胞 之竞争性结合。由CHO-衍生之2B8中所准备之2B8-MX- DTPA共轭物,与未共轭抗体在ORIGEN分析中利用直接 竞争法比较其结合。共轭物之准备系将2B8与MX-DTPA 在移去未反应之嵌合物之前,培育8,17及24小时。于 结合评估中,抗体与固定浓度之CD20-阳性的B-细胞( SB)及痕量的以钌-标志之CHO 2B8共培育。经过在环 境温度下培育3小时后,利用材料及方法中所述之 ORIGEN仪器决定以相对电化萤光(ECL)表示之结合。 所示出之数値代表二次决定値之平均。与未共轭 之2B8抗体比较下,共轭物制剂呈现相似之结合。 图37表自CHO 2B8-MX-DTPA制备之In2B8与CD20-阳性细胞之 结合。A)SB细胞以稀释缓冲溶液(1PBS,pH 7.4,含有1%(w /v)牛血清白蛋白)洗涤并再悬浮成90106细胞/毫升 。增量之细胞与7.5毫微克/毫升,In2B8共培育3小时, 后者利用2B8-MX-DTPA lot 0165A制备。B)细胞浓度对结 合之放射活性/总放射活性(B/AT)之双倒数作图。免 疫反应性以l/y-截矩100来计算。免疫反应性及校 正系数(R)値分别是80.6%及0.981。 图38表自CHO 2B8-MX-DTPA制备之Y2B8与CD20-阳性细胞之 结合。A)SB细胞以稀释缓冲溶液(1PBS,pH 7.4,含有1%(w /v)牛血清白蛋白)洗涤及再悬浮至90106细胞/毫升 。增量之细胞与2毫微克/毫升Y2B8共培育3小时,其 系利用2B8-MX-DTPA lot#0165A制备。B)细胞浓度对结合 之放射活性/总放射活性(B/AT)之双倒数作图。免疫 反应性以l/y-截矩100来计算。免疫反应性及校正 系数(R)値分别是72.2%及0.999。 |
