表达传染性法氏囊病毒VP5基因编码蛋白永生化细胞制备方法

摘要

本发明公开了一种表达传染性法氏囊病毒VP5基因编码蛋白永生化细胞制备方法。反转录获得传染性法氏囊病毒基因组cDNA，PCR扩增VP5基因片段与哺乳动物细胞真核表达pCI－neo构建成重组表达质粒。在Lipofectamine 2000介导下转染Vero细胞，在G418的抗性下，通过极限稀释法克隆单细胞，经PCR、RT－PCR、Southern blot、Northern blot、IFA/IPMA检测，获得含目的基因的克隆化细胞系，经反复传代培养后不丢失。这些细胞系可作为研究传染性法氏囊病毒基因编码蛋白对宿主细胞基因表达调控的载体，以及将表达传染性法氏囊病毒VP5基因编码蛋白应用于传染性法氏囊病的免疫接种。本发明应用基因工程技术、细胞重组技术制备表达传染性法氏囊病毒VP5基因编码蛋白的永生细胞，具有重复性强、稳定性好，再生能力强等特点。

主权项

1.一种表达传染性法氏囊病毒VP5基因编码蛋白永生化细胞制备方法，其特征在于它的步骤如下：1)自传染性法氏囊病毒抽提病毒RNA，长距离一步法RT-PCR扩增病毒全长cDNA，并以此为模板PCR扩增VP5基因片段与哺乳动物细胞真核表达pCI-neo构建表达质粒pCI-neo-VP5，经42℃热击转化CaCl2法制备的大肠杆菌Top10感受态细胞；2)用Luria-Bertani Medium作为基础培养基，各培养1-3ml浓度为1-1.5 OD600 值的含目的基因重组质粒的菌液，通过超纯质粒纯化试剂盒制备无内毒素的超纯质粒；3)用含10-15％小牛血清的Minimum Essential Medium作为基础培养基，各重组质粒经Opti-MEM稀释后在Lipofectamine 2000介导下转染90-95％融合的生长活力旺盛的单层Vero细胞；4)在含500μg/ml浓度G418的Minimum Essential Medium培养基中，通过极限稀释法获得单克隆化细胞；5)单克隆化细胞经PCR、RT-PCR、Southern blot、Northern blot和IFA/IPMA检测后，获得含有目的基因的永生化细胞。