发明名称 |
一种快速高效构建哺乳动物细胞RNA干扰载体及其验证载体的方法 |
摘要 |
本发明提出了一种快速高效构建哺乳动物细胞RNA干扰载体及其验证载体的方法。构建RNA干扰载体步骤为:1)插入致死基因ccdB表达单元,改造RNA干扰骨架载体;2)设计一对部分重叠,且带有针对目的基因靶序列的寡核苷酸引物;3)反向PCR、转化及筛选重组质粒,得到针对目的基因特异性的RNA干扰载体。构建RNA干扰验证载体步骤为:1)插入致死基因ccdB表达单元,改造RNA干扰验证的骨架载体;2)设计一对部分重叠,且含有需验证的靶序列的寡核苷酸引物,3)反向PCR扩增、转化及筛选得到靶序列和报告基因融合的RNA干扰验证质粒。本发明实验周期短、成本低;是一个非常有效地构建哺乳动物细胞RNA干扰载体及其验证载体的方法。 |
申请公布号 |
CN101139615A |
申请公布日期 |
2008.03.12 |
申请号 |
CN200710052912.3 |
申请日期 |
2007.08.06 |
申请人 |
湖北大学 |
发明人 |
马立新;孙晓艳;徐俊;曾洁琼;李春华 |
分类号 |
C12N15/85(2006.01) |
主分类号 |
C12N15/85(2006.01) |
代理机构 |
武汉金堂专利事务所 |
代理人 |
丁齐旭 |
主权项 |
1.一种快速高效构建哺乳动物细胞RNA干扰载体的方法,特征在于:1)对RNA干扰载体进行改造,在载体的控制RNA干扰单元表达的启动子与终止信号之间克隆一ccdB基因表达单元,得到表达表达发夹RNA(shorthairpin,shRNA)的RNA干扰骨架载体;2)引物设计,设计针对目的基因进行RNA干扰的靶序列,根据1)所述的RNA干扰骨架载体的控制RNA干扰单元表达的启动子和终止信号序列,设计一对部分重叠,且带有针对目的基因靶序列的寡核苷酸引物;3)反向PCR扩增、转化及筛选重组质粒,利用2)所述的引物,以1)所述的RNA干扰骨架载体为模板,进行PCR扩增;PCR产物转化大肠杆菌感受态细胞,PCR产物经同源重组自环化,得到表达目的基因特异性的RNA干扰载体。 |
地址 |
430062湖北省武汉市武昌区学院路11号 |