检测碱性鞘磷脂酶的分析方法以及用于该方法的试剂盒

摘要

本发明披露了一种荧光分析方法及用于该方法的检测试剂盒，该方法用于检测需要此种检测的患者粪便中的碱性鞘磷脂酶(SMase)，因为碱性SMase是重症病理状态，如结肠癌，的标记物。

主权项

1.一种检测患者粪便中的碱性鞘磷脂酶的方法，包括以下步骤：1)收集患者的粪便样品并使其干燥；2)称取大约3-4克干燥样品，并悬浮于20ml包含0.25M蔗糖、0.15M的KCl、50mM的KH2PO4并且pH值为7.4的匀浆缓冲液中；3)在+4℃，4000rpm下离心样品60分钟；4)回收上清液，再在+4℃，4000rpm下离心15分钟；5)应用Pierce Protein Assay测定上清液中的蛋白含量，使用牛血清白蛋白作为标准参照，对于每个样品，所用的蛋白浓度在32mg/ml-40mg/ml之间，吸取25μl各样品至孔中；6)向各25μl样品加入65μl包含50mM Tris/HCl、2mM EDTA、0.15M NaCl的pH值为9.0的检测缓冲液和10μl 29μM的鞘磷脂，并向检测缓冲液中加入3mM浓度的胆盐(TC、TDC、GC、GCDC)；7)在37℃下孵育1小时；8)吸取每种冷冻干燥的细菌鞘磷脂酶标准参照100μl和10μl神经鞘磷脂(29μM)，与样品一样在37℃下孵育1小时；9)1小时后，加入100μl包含50mM的pH值为7.4的Tris/HCl、10mM β-磷酸甘油、750μM ATP、5mM EDTA、5mM EGTA、100μM的Amplex Red、8U/ml碱性磷酸酶、0.2U/ml胆碱氧化酶、2U/ml辣根过氧化酶的反应缓冲液；10)在避光条件下于37℃孵育反应物1小时或更长时间；11)用荧光微板读取器检测荧光，其中激发波长为530-560nm，并在590nm处检测发射光；12)对每一个值，通过减去非鞘磷脂酶对照的值来对背景荧光进行校正。