一种农杆菌介导转化柳枝稷的方法

摘要

本发明公开了一种农杆菌介导转化柳枝稷的方法。利用农杆菌介导转化柳枝稷时，选择人工诱导的幼穗为外植体，在SMB培养基上诱导胚性愈伤组织，采用农杆菌转化和共培养，在筛选培养基SM1和SM2上依次进行筛选获得抗性愈伤组织，将抗性愈伤组织转入分化培养基SMK1和SMK2上依次分化获得再生植株，再生植株在生根培养基SMO中培养成苗，移栽至温室或大田进行分子生物学方法检测，根据分子生物学方法和目标性状筛选获得外源目的基因表达的转基因植株。本发明建立的柳枝稷遗传转化方法，转化效率达到10％左右，为采用转基因方法对生物能源植物柳枝稷的遗传改良奠定了基础。

主权项

1.一种农杆菌介导转化柳枝稷的方法，其特征在于，该方法按如下步骤进行：步骤一：人工诱导幼穗为外植体在柳枝稷生长发育至有6个节时，人工切取最上处茎节，切取部位包含茎节上下区段长度各1～1.5cm，灭菌；以MBP培养基上人工诱导幼穗，其中MBP培养基为：MS无机盐和维生素混合物4.43g/L、麦芽糖30g/L、6-苄基氨基嘌呤3mg/L、琼脂粉7.5g/L，PH＝5.8，28℃条件下光照培养至幼穗长度为1～1.5cm；步骤二：诱导胚性愈伤组织将人工诱导幼穗切成0.2mm，同一人工诱导幼穗的切块置于同一器皿中，24℃条件下以SMB培养基暗培养，诱导胚性愈伤组织，其中，SMB培养基的配方为：MS无机盐和维生素混合物4.43g/L、蔗糖30g/L、2，4-二氯苯氧乙酸5mg/L、6-苄基氨基嘌呤0.15mg/L、聚乙烯吡咯烷酮4.0g/L、琼脂粉7.0g/L，PH＝5.8；步骤三：农杆菌转化和共培养挑取农杆菌一单克隆于含有卡那霉素和利福平的50mL的LB或AB培养基中，在28℃条件下，以200rpm/分钟～250rpm/分钟培养1～2天，至农杆菌菌株浓度为OD600＝0.8～1.0；其中，LB培养基为：10g胰化蛋白胨，5g酵母提取物，10g氯化钠，PH＝7.0；AB培养基为：AB无机盐和磷酸盐溶液，葡萄糖5g/L，PH＝7.0；在LB或AB培养基中加入50μl 100mM乙酰丁香酮继续培养1～2小时；将培养基转入无菌的50mL离心管中，常温下，3500rpm/分钟，离心15分钟收集农杆菌，以液体M1培养基重新悬浮农杆菌，调节农杆菌菌株浓度为OD600＝0.5；其中，液体M1培养基为：MS无机盐和维生素混合物4.43g/L、蔗糖30g/L、2，4-二氯苯氧乙酸1.5mg/L PH＝5.8；用镊子将愈伤组织夹成直径为1mm～2mm的块状，加入悬浮好的农杆菌菌液，同时加入40μl 100mM乙酰丁香酮，在真空台上抽真空10～15分钟后，常温下，以50rpm/分钟～60rpm/分钟培养20分钟～30分钟；弃去全部农杆菌菌液，用无菌滤纸吸去愈伤组织表面残留的菌液，然后将愈伤组织转入用筛选培养基SM1充分浸透过的无菌滤纸上，在20℃～24℃条件，暗培养2～3天；步骤四：抗性愈伤组织的筛选将愈伤组织转入筛选培养基SM1，24℃，暗培养2星期，然后转入筛选培养基SM2，24℃，暗培养4星期；其中，筛选培养基SM1为：MS无机盐和维生素混合物4.43g/L、蔗糖30g/L、2，4-二氯苯氧乙酸1.5mg/L、潮霉素75mg/L、头孢霉素250mg/L、琼脂粉7.5g/L，PH＝5.8；筛选培养基SM2为：MS无机盐和维生素混合物4.43g/L、蔗糖30g/L、2，4-二氯苯氧乙酸1.5mg/L、潮霉素50mg/L、头孢霉素250mg/L、琼脂粉7.5g/L，PH＝5.8；在此培养期间，若发现有农杆菌污染的愈伤组织，及时将同皿的其他正常愈伤组织转入新的筛选培养基筛选；步骤五：抗性愈伤组织的分化将经过筛选获得的抗性愈伤组织转入分化培养基SMK1，28℃，光照条件下培养2～3星期，然后转入分化培养基SMK2，28℃，光照条件下培养3～4星期；其中，分化培养基SMK1为：MS无机盐和维生素混合物4.43g/L、蔗糖30g/L、激动素0.2mg/L、潮霉素25mg/L、头孢霉素250mg/L、琼脂粉7.5g/L，pH＝5.8；分化培养基SMK2为：MS无机盐和维生素混合物4.43g/L、蔗糖30g/L、激动素0.2mg/L、头孢霉素250mg/L、琼脂粉7.5g/L，pH＝5.8；步骤六：再生转化苗的生根培养当再生苗生长1cm～2cm高时，转入生根培养基SMO中，28℃，光照条件下培养3～4星期至幼苗高度为5cm以上，其中，生根培养基SMO为：MS无机盐和维生素混合物2.22g/L、蔗糖8g/L、琼脂粉7.0g/L，pH＝5.8；步骤七：移栽至温室进行分子生物学方法检测再生植株移栽至温室中，在幼苗4～6叶期，取叶片进行PCR和GUS检测，根据前期检测结果，在植株生长至6～8叶期时，对PCR检测阳性植株进行Southern杂交，获得含有目标基因的转化植株；步骤八：目的基因表达的转基因植株的获得根据目的基因表达时期不同，对Southern杂交检测阳性植株在相关时期进行RT-PCR、Nouthern杂交和Western杂交检测，同时根据目标性状，筛选获得目的基因表达的转基因植株。