添有扩增内标的副溶血弧菌PCR检测方法

摘要

本发明涉及的是一种食品安全技术领域的添有扩增内标的副溶血弧菌PCR检测方法。本发明包括(1)人工构建合成扩增内标序列，并设计特异引物；(2)使PCR反应体系处于最优的反应条件；(3)PCR扩增；(4)提取不同血清型的副溶血弧菌和不同种属的非副溶血弧菌菌株的DNA，进行PCR检测，确定引物的特异性及扩增内标在非副溶血弧菌样品检测中是否能够正常扩增；(5)通过人工污染样品和自然污染样品的检测对所建立的PCR反应体系进行评价。本发明检测时显示假阴性的发生，提高准确率，为满足检疫执法过程中所急需的对食源性致病菌调查和检测提供有效可靠的技术手段。

主权项

1.一种添有扩增内标的副溶血弧菌PCR检测方法，其特征在于，具体步骤如下：(1)构建合成扩增内标，并设计特异引物；(2)通过对MgCl2浓度和退火温度Tm值进行优化选择；(3)首先经过测定的副溶血弧菌总DNA溶液用无菌水作10倍梯度稀释至10-8，以稀释的DNA溶液为模板，分别取5μL加入PCR反应体系，进行PCR检测，同时以猪霍乱沙门氏菌标准株DNA模板作阴性对照，以无菌水代替DNA模板作空白对照，确定PCR的检测灵敏度；然后，取带有扩增内标的载体，添加到PCR反应体系中：通过向反应体系中添加不同稀释浓度的扩增内标，检测DNA或菌株的灵敏度，选择对检测灵敏度影响最小且能够明确指示假阴性的扩增内标的浓度作为添加浓度；(4)提取不同血清型的副溶血弧菌和不同种属的非副溶血弧菌菌株的DNA，进行PCR检测，确定引物的特异性及扩增内标在非副溶血弧菌样品检测中是否能够正常扩增；(5)通过人工污染样品和自然污染样品的检测对所建立的PCR反应体系进行评价。