| 主权项 |
1.一种在原核细胞中制备重组DNA-衍生组织胞浆素 原活化子(tPA)或Kringle 2丝胺酸蛋白分子(K2S)之方 法,其中该tPA或K2S分子系呈活化及正确摺叠之形式 分泌至细胞外,其特征为该原核细胞含有并表现编 码该tPA或K2S分子之DNA,该tPA或K2S分子系经操作连接 至编码讯号胜OmpA之DNA。 2.根据申请专利范围第1项之方法,其特征为该原核 细胞表现编码该tPA或K2S分子之DNA,该tPA或K2S分子系 经操作连接至编码讯号胜OmpA之DNA,该编码讯号 胜OmpA之DNA系经操作连接至序列TCTGAGGAAACAGTGAC(SEQ ID NO:1)之核酸分子。 3.根据申请专利范围第1或2项之方法,其特征为该 原核细胞系为大肠杆菌E. coli。 4.根据申请专利范围第1或2项之方法,其特征为实 施下列步骤: a)藉由PCR增幅编码该tPA或K2S分子之DNA; b)纯化PCR产物; c)将该PCR产物嵌入包含编码OmpA信号胜之DNA及编 码gpIII之DNA之pComb3HSS载体内,其使用之方法可使该 PCR产物经操作连接至该载体之编码OmpA信号胜之 DNA之上游并连接至编码gpIII之DNA之下游; d)于该tPA或K2S分子与gpIII之间嵌入终止密码组; e)藉由原核细胞表现该载体; f)纯化该tPA或K2S分子。 5.根据申请专利范围第1或2项之方法,其特征为该 DNA系插入pComb3HSS噬菌体质体载体。 6.根据申请专利范围第1或2项之方法,其特征为连 接于K2S上游之OmpA之DNA序列包含下列序列: 7.根据申请专利范围第1或2项之方法,其特征为该 OmpA之DNA序列包含下列序列: 8.根据申请专利范围第1或2项之方法,其特征为该 OmpA之DNA序列系由下列序列所组成: 9.根据申请专利范围第1或2项之方法,其特征为该 tPA或K2S分子之DNA系位于lac起动子及/或核醣体结合 位置之后。 10.根据申请专利范围第1或2项之方法,其特征为编 码该tPA或K2S分子之DNA系选自编码至少90%之人类组 织胞浆素原活化子蛋白质之胺基酸87-527,174-527,180- 527或220-527之DNA分子群。 11.根据申请专利范围第5项之方法,其特征为K2S之 DNA序列包含下列序列: 12.根据申请专利范围第5项之方法,其特征为K2S之 DNA序列系由下列序列组成: 13.一种DNA分子,其特征为其编码: a)OmpA蛋白质,其系经操作连接至 b)编码含有组织胞浆素原活化子蛋白质之kringle 2 功能区域及丝胺酸蛋白功能区域之多之DNA分 子; 其特征为该DNA序列a)系由下列序列所组成: 14.根据申请专利范围第13项之DNA分子,其特征为该 DNA序列包含下列序列: 15.根据申请专利范围第13项之DNA分子,其特征为该 DNA序列系由下列序列所组成: 16.根据申请专利范围第13项之DNA分子,其特征为该 DNA序列b)系编码至少90%之人类组织胞浆素原活化 子蛋白质之胺基酸87-527。 17.根据申请专利范围第13项之DNA分子,其特征为该 DNA序列b)系编码至少90%之人类组织胞浆素原活化 子蛋白质之胺基酸174-527。 18.根据申请专利范围第13项之DNA分子,其特征为该 DNA序列b)系编码至少90%之人类组织胞浆素原活化 子蛋白质之胺基酸180-527。 19.根据申请专利范围第13项之DNA分子,其特征为该 DNA序列b)系编码至少90%之人类组织胞浆素原活化 子蛋白质之胺基酸220-527。 20.根据申请专利范围第13或14项之DNA分子,其特征 为该DNA序列a)系于严苛条件下杂交至下列序列: 21.根据申请专利范围第13或14项之DNA分子,其特征 为该DNA序列b)系于严苛条件下杂交至下列序列: 22.根据申请专利范围第13或14项之DNA分子,其特征 为该DNA序列b)系由下列序列所组成: 23.根据申请专利范围第13或14项之DNA分子,其系用 于用以制备具有组织胞浆素原活化子之多之方 法中。 24.根据申请专利范围第23项之DNA分子,其中该方法 系为根据申请专利范围第1至12项之任一项之方法 。 25.一种OmpA与K2S之融合蛋白质,其特征为其包含具 下列胺基酸序列之特征之蛋白质: 26.根据申请专利范围第25项之OmpA与K2S之融合蛋白 质,其特征为其系由具下列胺基酸序列特征之蛋白 质所组成: 27.一种K2S蛋白质,其特征为其包含序列定义为SEGN( SEQ ID NO:9)之蛋白质。 28.根据申请专利范围第27项之K2S蛋白质,其特征为 其包含序列定义为SEGNSD之蛋白质(SEQ ID NO:10)。 29.根据申请专利范围第27或28项之K2S蛋白质,其特 征为其包含具下列胺基酸序列之特征之蛋白质: 30.根据申请专利范围第27或28项之K2S蛋白质,其特 征为其系由具下列胺基酸序列之特征之蛋白质所 组成: 31.一种K25蛋白质,其特征为其系由根据申请专利范 围第16至19项中任一项之DNA分子所编码。 图式简单说明: 图1.藉由利用SK2/174及ASSP引子确认来自p51-3载体之K 2S基因之PCR增幅产物。第1道显示1kb标示物(Roche Molecular Biochemicals,Indianapolis,IN)。第2道系载入1微 升之增幅产物。其显示1110bp处之单一横带。电泳 系于1%洋菜琼脂胶体上进行。 图2.pComb3H-K2S经SfiI水解后,于1110 bp(*)处之所欲K2S基 因之监定系显示于第3道。第1道显示1kb标示物。 一第2道系载入未切割之pComb3H-K2S。电泳系于1%洋 菜琼脂胶体上进行。 图3.pComb3H-K2S之图示,其显示两个SfiI选殖位置,其中 嵌入K2S基因。亦显示讯号序列(OmpA),核醣体结合位 置(RIBS),lac起动子,及gpIII基因。 图4.位于pComb3H-K2S上之K2S及gpIII交接处之突变位置 图示。pComb3H-K2S之链合位置系与一组含有经修饰 寡核甘(画线者)之突变引子(MSTPA及MASTPA)结合。进 行循环增幅后,Sfi I位置1(粗体字)被修饰并于新合 成股中丢失。 图5.以Sfi限制分析新合成之MpComb3H-K2S之特征。 相关于MpComb3H-K2S之单一切割位置之位于4319 bp处之 单一横带可见于第3道。并不见位于1110 bp处之K2S 嵌入带。第1道显示1kb标示物。第2道系载入未切 割之MpComb3H-K2S。电泳系于1%洋菜琼脂胶体上进行 。 图6.以自具有绵羊抗-tPA结合性HRP之E.coli XM[K2S]培 养上清液纯化之重组蛋白质监定具免疫反应带。 第1道载入40奈克之标准黑色素瘤tPA(86/670),其于70 kDa处显示反应带。将得自未转形E.coliXL-1 Blue及E. coli XM[K2S]之部分纯化及浓缩之培养上清液分别注 入第2及3道。清晰之反应带特别显示于第3道之39 kDa处。 图7.藉由共聚合之胞浆素原聚丙烯醯胺胶体电泳 测定内含活性丝胺酸蛋白功能区域之胞外r-K2S 之分子量。第1道含有指示性分子量标准品(10-3), SDS-6H(Sigma,Saint-Louis,MO)。将五十微克之经55%饱和硫 酸铵沉淀之E.coli XL-1 Blue,经pComb3HSS转形之E.coli XL-1 Blue,及E.coli XM[K2S]之培养上清液分别载入第2、3及 4道中。第5道含有50 mIU之标准黑色素瘤tPA(86/670)。 于聚丙烯醯胺胶体内之水解胞浆素原透明环仅可 见于第4道之分子量为34及37 kDa处(B)及第5道之分子 量为66及72kDa处(A)。 图8.结构A 来自无修饰之胺基酸174-527之原态K2S分子(SEQ ID NO: 11) 图9.结构B-0 来自无修饰之胺基酸197-527之原态K2S分子(SEQ ID NO: 12) 图10.结构B-1 来自胺基酸193-527之K2S分子,其中于图9之结构B-0之N 端部分加入胺基酸SEGN(SEQ ID NO:13) 图11.结构B-2 来自胺基酸193-527之K2S分子,如图10,其中之Cys-261改 变为Ser(SEQ ID NO:14) 图12.结构B-3 来自胺基酸191-527之K2S分子,其中于图9之结构B-0之N 端部分加入胺基酸SEGNSD(SEQ ID NO:15) 图13.结构B-4 来自胺基酸191-527之K2S分子,如图12,其中之Cys-261改 变为Ser(SEQ ID NO:16) 图14.结构C 来自无修饰之胺基酸220-527之原态K2S分子。此分子 可进一步以类似被揭示用于图10-13之结构B之方式 修饰(SEQ ID NO:17)。 图15.结构D 来自无修饰之胺基酸260-527之原态K2S分子。此分子 可进一步以类似被揭示用于图10-13之结构B之方式 修饰(SEQ ID NO:18)。 图16.tPA分子(SEQ ID NO:19) |
