甲胎蛋白(AFP)mRNA荧光定量RT－PCR检测试剂盒

摘要

本发明涉及一种甲胎蛋白(AFP)mRNA荧光定量RT-PCR检测试剂盒，该试剂盒包含总RNA提取液(细胞裂解液I、细胞裂解液II、RNA洗涤缓冲液I、RNA洗涤缓冲液II和无RNA酶的水)，反转录反应液，dNTP混合物，逆转录酶，PCR反应液，探针，阳性标准品，对照品。本发明通过对新鲜抗凝外周血提取总RNA，并通过逆转录mRNA样品得到cDNA，再结合实时荧光定量PCR检测技术，可准确定量检测标本中AFP的mRNA的表达量。本发明所提供的试剂盒可用于临床及科研中检测肿瘤患者的外周血、骨髓、淋巴结及癌组织中AFP mRNA的表达，为原发性肝癌的早期诊断、转移、复发、治疗方案的确定及预后的判断提供重要的参考依据。

主权项

1.甲胎蛋白mRNA荧光定量RT-PCR检测试剂盒，其特征为：它包含细胞裂解液I、细胞裂解液II、RNA洗涤缓冲液I、RNA洗涤缓冲液II、无RNA酶的水、RNA分离柱、反转录缓冲液、dNTP混合物、逆转录酶储存液、PCR反应液、探针、标准品、对照品；以上各种溶液所用溶剂均为水；(1)、细胞裂解液I包含0.1mol/L三羟甲基氨基甲烷-盐酸、0.1mol/L氯化钠、0.05mol/L氯化镁、水；其中0.1mol/L三羟甲基氨基甲烷-盐酸溶液在25℃条件下，pH值为7.6；(2)、细胞裂解液II包含3mol/L异硫氰酸胍、2mol/L盐酸胍、0.3mol/L醋酸钠、重量体积比为0.2％的十二烷基硫酸钠、水；其中0.3mol/L醋酸钠溶液pH值为5.2；(3)、RNA洗涤缓冲液I包含0.2mol/L醋酸钠、0.1mol/L氯酸钠、0.1mol/L三羟甲基氨基甲烷-盐酸、水；其中0.2mol/L醋酸钠溶液pH值为5.2；0.1mol/L三羟甲基氨基甲烷-盐酸溶液在25℃条件下，pH值为7.5；(4)、RNA洗涤缓冲液II包含1.2mol/L柠檬酸钠、0.5mol/L三羟甲基氨基甲烷-盐酸、水；其中0.5mol/L三羟甲基氨基甲烷-盐酸溶液在25℃条件下，pH值为7.5；(5)、无RNA酶的水制备方法为：向去离子水加入焦碳酸二乙酯，至体积终浓度为0.05％，22-25℃放置10-12小时后，121℃，20min高压，22-25℃放置备用；(6)、RNA分离柱是一种硅胶柱，可以特异性结合RNA，并可用水洗脱RNA，达到分离纯化RNA的目的；(7)、反转录缓冲液包含9.1μmol/L Oligo(dT)12-18、3.6U/μlRNA酶抑制剂、72.7mmol/L二硫苏糖醇、182mmol/L三羟甲基氨基甲烷-盐酸、273mmol/L氯化钾、11mmol/L氯化镁、水；其中182mmol/L三羟甲基氨基甲烷-盐酸溶液在25℃条件下，pH值为8.3；(8)、逆转录酶储存液包含20mmol/L三羟甲基氨基甲烷-盐酸、100mmol/L氯化钠、0.1mmol/L乙二胺四乙酸、1.0mmol/L二硫苏糖醇、体积比为50％的甘油、体积比为0.01％的Nonidet p-40、200U/μl逆转录酶、水；其中20mmol/L三羟甲基氨基甲烷-盐酸溶液在25℃条件下，pH值为7.5；(9)、dNTP混合物包含dATP、dCTP、dGTP、dTTP，为其钠盐-水溶液，pH7.0-7.5，四种dNTP浓度均为10mmol/L；(10)、PCR反应液包含18.5mmol/L三羟甲基氨基甲烷-盐酸、2.78mmol/L氯化镁、92.6mmol/L氯化钾、0.37μmol/ L上下游引物、0.1U/μl Taq酶、400nmol/L dATP、400nmol/L dCTP、400nmol/LdGTP、400nmol/L dTTP、水；其中18.5mmol/L三羟甲基氨基甲烷-盐酸溶液在25℃条件下，pH值为8.3；上下游引物序列分别为：P1：5’-TGA CTC CAG TAA ACC CTG GT-3’P2：5’-AGA AAT CTG CAA TGA CAG CC-3’(11)、探针为荧光标记探针，其序列为：5’-FAM-TGC TGC ACT TCT TCA TAT GCC AAC A-TAMRA-3’探针的浓度为：2μmol/L，TE溶液溶解，TE溶液的组成为10mmol/L三羟甲基氨基甲烷-盐酸，1mmol/L乙二胺四乙酸，水；(12)、标准品的序列为：1 AGAAATCTGC AATGACAGCC TCAAGTTGTT CCTCTGTTAT TTGTGGCTTT51 TGCTTCACAA GGTTAATGAG AAACTCTTGC TTCATCGTTT GCAGCGCTAC101 ACCCTGAGCT TGGCACAGAT CCTTATGGAA AATGAACTTG TCATCAGAGA151 ATGCAGGAGG GACATATGTT TCATCCACCA CCAAGCTGCT GAAGCATGGC201 CTCCTGTTGG CATATGAAGA AGTGCAGCAC TGGCCAACAC CAGGGTTTAC251 TGGAGTCA标准品浓度为：106 copies/μl，TE溶液溶解，TE溶液的组成为10mmol/L三羟甲基氨基甲烷-盐酸，1mmol/L乙二胺四乙酸，水；(13)、对照品分为阳性对照品与阴性对照品，阳性对照品为有AFP cDNA的样品，浓度为104copies/μl，TE溶解，阴性对照品为外周血总RNA的反转录产物。