将富含G+C 启动区结合蛋白质多编码之分离去氧核糖核酸、包含此种去氧核糖核酸之载体、分离之富含G+C启动区结合蛋白质多以及结合于富含G +C启动ISOLATED DNA ENCODING A GPBP POLYPEPTIDE, VECTORS COMPRISING SUCH DNA, ISOLATED GPBP POLYPEPTIDES, AND ISOLATED ANTIBODIES THAT BIND TO GPBP POLYPEPTIDES ISOLATED DNA ENCODING A GPBP POLYPEPTIDE, VECTORS COMPRISING SUCH DNA, ISOLATED GPBP POLYPEPTIDES, AND ISOLATED ANTIBODIES THAT BIND TO GPBP POLYPEPTIDES

摘要

本发明有关分子生物学及生物技艺之领域，而更明确为有关转录调节之领域。所揭示为一种新颖之富含G+C启动区之转录调节因子、鼠类富含G+C启动区结合用蛋白质(mGPBP)、及其与其他转录因子之交作图型。

主权项

1.一种将GPBP多编码之分离DNA,所述GPBP多具有 一由下列所组成集团中选出之胺基酸序列: a.序列识别编号2中列示之胺基酸序列: 以及 b.序列识别编号4中列示之胺基酸序列: 。 2.如申请专利范围第1项之DNA,其中所述GPBP多专 一结合于一富含G+C启动区。 3.如申请专利范围第2项之DNA,其中该富含G+C启动区 为ADA基因之最小量自足启动区元素(MSPE)。 4.一种包含申请专利范围第1至3项中任一项之DNA序 列之载体。 5.一种分离之GPBP多,具有一由下列所组成集团中 选出之序列: a.序列识别编号2中列示之胺基酸序列: 以及 b.序列识别编号4中列示之胺基酸序列: 。 6.如申请专利范围第5项之GPBP多,其中所述多 专一结合于一富含G+C启动区。 7.如申请专利范围第6项之GPBP多,其中该富含G+C 启动区为ADA基因之最小量自足启动区元素(MSPE)。 8.一种结合于申请专利范围第5至7项中任一项之多 之分离抗体。 9.如申请专利范围第1项之DNA,其中所述DNA具有序列 识别编号1中列示之核酸序列: 10.如申请专利范围第1项之DNA,其中所述DNA具有序 列识别编号3中列示之核酸序列: 图式简单说明: 图1:mGPBP序列及序列同源性。A段中所示为对应于3. 0 kb鼠类GPBP mRNA之整个cDNA序列,包括由开放性读码( ORF)编码之推演胺基酸序列。序列同源性搜寻显露 在胺基酸序列位准上与若干已知之蛋白质有小区 域序列同源性,如B段中所示。ORF示如一闭实之匣 子,而与酵母TFIIF亚单位(yTFIIF)、酵母ARS结合 因子1(yABF-1)、鼠类结构专一性识别蛋白质1(类mHMG- 1 [SSRP-1])、及解螺旋(helicase)同源之区域显示如 空匣子。 图2:Northern印迹分析检验鼠类GPBP mRNA物种及组织分 布。每一行均荷载约3微克由所指示组织衍生之多 聚腺核酸RNA。A段中所示印迹先用一mGPBP专一探 体予以探测(上方画面),剥取,并用一放线素探体 再探测(下方画面)。在B段中,印迹用衍生自mGPBP cDNA之5'端之2.0 kb探体探测(左方画面),剥取,并用一 由对应于3.5kb mGPBP mRNA之mGPBP cDNA之3'端衍生之350 bp 探体再探测(右方画面)。该5'探体与二者mRNA物种 杂交,而该3'探体仅与3.5kb mRNA杂交。 图3:哺乳类GPBP大小约为66kD且以随遇方式表现。A 段第1-5行显示在用库玛西蓝所染色SDS聚丙烯醯胺 凝胶内之电泳分离蛋白质。在无(-)或有(+)IPTG诱导 作用之情况分析由一携带PET-mGPBP表现作用质粒之 BL21系衍生之细菌溶出物。第4行显示纯化重组mGPBP 。分子量记号示于第1及5行。第3及4行中所用相同 亦用抗mGPBP抗血清作为探体以Western印迹法分别分 析于第7及8行。对照组BL21细胞(无PET-mGPBP表现作用 质粒)溶出物分析于第6行。B段显示由人类HeLa细胞 (第1行)、老鼠C1-1D细胞(第2行)、人类JEG-3细胞(第3 行)、人类VA-2细胞(第4行)、老鼠M2-10B4细胞(第5行) 及人类293细胞(第6行)衍生之细胞溶出物用抗mGPBP 抗血清作为探体之Western印迹分析。 图4:纯化重组mGPBP可于EMSA中专一结合于老鼠ADA基 因之富含G+C启动区。A段中所用DNA探体4C'为已予末 端连接之MSPE C'之4个复本。纯化mGPBP专一结合于该 探体并导致探体电泳淌度从自由探体位置(第1行) 到结合探体位置(第2行)之变迁。此项结合可特别 藉由添加35倍(第3行)及175倍(第4行)之超量未标记 探体胜出,但不能藉由添加类似量之未标记E2F结合 用主题段(第5及6行)或200 bp质粒序列(第7及8行)胜 出。此片段C'在加标记236 bp老鼠ADA基因启动区情 况下之单一复本亦可结合于纯化rmGPBP并受其以电 泳方式阻滞(B段第1及2行)。此项结合可藉由超量 之未标记探体(第3及4行)或藉由A段中所用C'探体( 第5及6行)胜出。同样,此项结合非藉由未标记E2F结 合用序列(第7及8行)或200 bp质粒序列(第9及10行)胜 出。 图5:人类及已转染mGPBP二者局部化于核内。用抗 mGPBP抗体(N80)(A段上方)或由前免疫血清(B段上方)将 人类HeLa细胞染色。核位置用DAPI(A及B段下方)将细 胞复染色予以确定。于C段中用N80(C段上方)及抗HA 抗体(C段下方)将已转染之加HA标签mGPBP局部化。 图6:mGPBP能与多种转录起始作用复合体组配专一性 因子复合。(A)让老鼠C1-1D核萃取物蛋白质结合于 珠粒所固定之GST-mGPBP融合蛋白。以Western印迹法分 析各种蛋白质,包括起始核萃取物(输入)、结合于 珠粒所固定之GST或GST-mGPBP融合蛋白(结合于)、以 及不结合于珠粒所固定之GST或GST-mGPBP融合蛋白(未 结合上澄液)。用以探测此等印迹之抗体予对抗TBP 、RNA聚合Ⅱ之C-末端结构域(RNA pol II CTD)、转录 分量IIB(TFIIB)、转录分量IIF RAP30(TFIIF RAP30)、P300/ CAAT结合用蛋白质(CBP)、及对抗核被膜蛋白质 Nucleoporin p62之负对照组抗体。相较于蛋白质大小 记号之每一带中以电泳淌度为准之蛋白质估计分 子量(单位kD)以箭头示于右方。(B)藉细胞溶出物免 疫共同沉淀分析测定mGPBP之活体内结合作用。 Western印迹分析显示在细胞已用表现HA标签(HA)单一 项或融合于mGPBP之HA标签(HA-mGPBP)之表现作用载体 转染后,无免疫共同沉淀(输入溶出物),或在与抗HA 标签之抗体免疫共同沉淀(IP HA Ab)后之C1-1D细胞 溶出物蛋白质。对抗TBP、RNA pol II CTD、TFIIB、CBP、 或HA标签所培育之抗体予用作探体,如各印迹中所 示。相较于蛋白质大小记号之每一带中以电 泳淌度为准之蛋白质估计分子量(单位kD)以箭头显 示。该HA-mGPBP融合蛋白亦以一箭头示于该段右方 。 图7:对于在老鼠ADA基因之富含G+C启动区所起始之 转录作用特别需要mGPBP。将老鼠ADA基因启动区所 控制虫萤光素报导基因构造与渐增量之mGPBP表 现作用载体共同转染随老鼠C1-1D细胞或人类293细 胞即造成线性增加之报导基因活性(A段)。藉超螺 旋化老鼠ADA基因启动区所控制去G卡式报导基因与 老鼠C1-1D细胞核萃取物之执行之活体内转录分析 显示报导基因转录本生成作用不因添加渐增量之 前免疫血清衍生抗体而改变(B段第1-3行)。发现,渐 增量之抗mGPBP抗体导致报导基因转录本生成作用 渐减(B段第4-9行)。此免疫遏制效应可藉添加纯化 rmGPBP予以逆转(B段第10及11行)。去G卡式报导基因 在TATAAA匣相依腺病毒主要后期启动区控制下之转 录不受添加抗mGPBP抗体之影飨(B段第12-15行)。分析 结果至少重复3次,而转录分析结果之标准化定量( 使用磷成像剂)并同多次重腹之标准偏差以图表形 式示于C段。 图8:人类富含G+C启动区结合用蛋白质cDNA及推定蛋 白质序列之排列。