| 主权项 |
1.一种促进细胞生长之方法,包含下列步骤: (a)将一编码为天冬胺酸分解之核酸序列选殖于 一载体,以成为一重组载体,其中前述重组载体系 包含:一以异丙基硫代半乳糖喃(IPTG)调控之启 动子;一编码为天冬胺酸分解之核酸序列SEQ ID NO :7,该核酸序列可操控连接并插入该启动子之下游; (b)将步骤(a)之重组载体转形至一宿主细胞,以产生 一重组型宿主细胞,其中前述宿主细胞系大肠杆菌 (E. coli);及 (c)将步骤(b)之重组型宿主细胞培养于含有天冬胺 酸之培养基中,使细胞中之天冬胺酸分解之基因 表现,进而促进前述重组型宿主细胞之生长。 2.如申请专利范围第1项所述之方法,其中前述步骤 (a)之启动子系包含组成性(constitutive)启动子或其 他可调控之启动子。 3.如申请专利范围第1项所述之方法,其中前述培养 基系为LB。 4.如申请专利范围第1项所述之方法,其中前述培养 基系包含LB以及葡萄糖。 5.如申请专利范围第1项所述之方法,其中前述培养 基系包含M9、葡萄糖以及天冬胺酸,其中M9含有Na2 HPO4(6g/L)、KH2PO4(3 g/L)、NaCl(0.5g/L)、NH4Cl(1g/L)、MgSO4 7H2O(1 mM)、CaCl2(0.1 mM)。 6.如申请专利范围第1项所述之方法,其中前述培养 基系包含M9、葡萄糖、酵母萃取物与天冬胺酸,其 中M9含有Na2HPO4(6g/L)、KH2PO4(3 g/L)、NaCl(0.5g/L)、NH4Cl( 1g/L)、MgSO47H2O(1 mM)、CaCl2(0.1 mM)。 7.一种增加细胞生产目标基因产物生产量之方法, 包含下列步骤: (a)建构一含有编码天冬胺酸分解之核酸序列之 重组载体,其中前述重组载体系包含:一以异丙基 硫代半乳糖喃(IPTG)调控之启动子;一编码为天 冬胺酸分解之核酸序列SEQ ID NO:7,该核酸序列可 操控连接并插入该启动子之下游; (b)建构一含有欲表达之目标基因之重组载体,其包 含:一以异丙基硫代半乳糖喃(IPTG)调控之启动 子;一欲表达之目标基因之核酸序列,该核酸序列 可操控连接并插入该启动子之下游; (c)将步骤(a)与(b)之重组载体共同转形至一宿主细 胞,产生一重组型宿主细胞,其中前述宿主细胞系 大肠杆菌;及 (d)将步骤(c)之重组型宿主细胞培养于含有天冬胺 酸之培养基中,并诱导使前述重组型宿主细胞生产 天冬胺酸分解以及欲表达之目标基因产物,其中 前述天冬胺酸分解系可增加前述重组型宿主细 胞生产欲表达之目标基因产物之生产量。 8.如申请专利范围第7项所述之方法,其中前述含有 编码天冬胺酸分解之核酸序列之重组载体的启 动子系包含组成性(constitutive)启动子或其他可调 控启动子。 9.如申请专利范围第7项所述之方法,其中前述含有 欲表达之目标基因之重组载体的启动子系包含组 成性(constitutive)启动子或其他可调控启动子。 10.如申请专利范围第7项所述之方法,其中前述步 骤(d)中之目标基因产物包含重组蛋白质或多。 11.如申请专利范围第10项所述之方法,其中前述重 组蛋白质包括异源蛋白质或同源蛋白质。 12.如申请专利范围第11项所述之方法,其中前述之 异源蛋白质系为水母绿色萤光蛋白质。 13.如申请专利范围第11项所述之方法,其中前述之 同源蛋白质系为-半乳糖分解。 14.如申请专利范围第7项所述之方法,其中前述之 培养基系包含LB。 15.如申请专利范围第7项所述之方法,其中前述之 培养基系包含LB以及葡萄糖。 16.如申请专利范围第7项所述之方法,其中前述之 培养基系包含M9、葡萄糖以及天冬胺酸,其中M9含 有Na2HPO4(6g/L)、KH2PO4(3 g/L)、NaCl(0.5g/L)、NH4Cl(1g/L)、 MgSO47H2O(1 mM)、CaCl2(0.1 mM)。 17.如申请专利范围第7项所述之方法,其中前述之 培养基系包含M9、葡萄糖、酵母萃取物与天冬胺 酸,其中M9含有Na2HPO4(6g/L)、KH2PO4(3 g/L)、NaCl(0.5g/L) 、NH4Cl(1g/L)、MgSO47H2O(1 mM)、CaCl2(0.1 mM)。 图式简单说明: 第一图系显示大肠杆菌细胞内之中枢代谢(central metabolism)包括糖分解和三羧酸循环代谢途径。其 中ppc,磷酸烯醇丙酮酸酸基化(phsophoenolpyruvate carboxylase)基因;aspA,天冬胺酸分解(aspartase)基因; NADH,菸醯胺腺嘌呤二核酸(nicotinamide-adenine dinucleotide)。 第二图系质体pA199A-2之架构图。其中含有:pMB1 ori, 质体pMB1的复制源点;PA1,T7 A1启动子;lacI,lacI抑制蛋 白质基因;rrnBT1T2,rrnB基因转录终止位址( transcriptional termination site);Apr,胺苄青霉素抗性基 因;以及多重选殖位址(multiple cloning site, MCS),其中 所包含的核糖体结合位址(RBS)与限制切割位置 被标示于MCS框内。 第三图系质体pA1-AspA之架构图。其中含有:pMBlori, 质体pMB1的复制源点;PA1,T7 A1启动子;lacI,lacI抑制蛋 白质基因;rrnBT1T2,rrnB基因转录终止位址;Apr,胺苄青 霉素抗性基因;aspA,天冬胺酸分解结构基因( structural gene);BamHI,限制BamHI切割位址;HindIII,限制 HindIII切割位址;NruI,限制NruI切割位址。 第四图系质体pACYC184之架构图。其中含有Cmr,氯霉 素抗性基因;p15A ori,质体p15A的复制源点;Tcr,四环素 抗性基因;NruI,限制NruI切割位址;HindIII,限制 HindIII切割位址。 第五图系质体pACYC-AspA之架构图。其中含有Cmr,氯 霉素抗性基因;p15A ori,质体p15A的复制源点;PA1,T7 A1 启动子;aspA,天冬胺酸分解结构基因;lacI,lacI抑制 蛋白质基因;BamHI,限制BamHI切割位址;NruI,限制 NruI切割位址;HindIII,限制HindIII切割位址。 第六图系一生产天冬胺酸分解之重组型大肠杆 菌的蛋白质电泳图。 第七图系一重组型菌株VJS676/pA199A-2和VJS676/pA1-AspA 于M9添加葡萄糖以及M9添加葡萄糖和天冬胺酸之营 养基的生长曲线图。其中加入300MIPTG进行诱导( 如箭头指示处)。 第八图系一重组型菌株VJS676/pA199A-2和VJS676/pA1-AspA 于LB营养基的生长曲线图。其中加入300M IPTG进 行诱导(如箭头指示处)。 第九图系质体pAH55之架构图。其中含有Kmr,康那霉 素(kanamycin)抗性基因;R6K ori,质体R6K的复制源点;Ptac ,tac启动子;lacIq,lacI抑制蛋白质基因;t0,噬菌体的 基因转录终止位址。 第十图系质体pTrc99A之架构图。其中含有Apr,胺苄 青霉素抗性基因;Ptrc,trc启动子;lacIq,lacI抑制蛋白 质基因;rrnBT1T2,rrnB基因转录终止位址;EcoRV,限制 EcoRV切割位址;以及多重选殖位址,其限制切割位 置被标示于MCS框内。 第十一图系质体pTac99A之架构图。其中含有Apr,胺 苄青霉素抗性基因;Ptac,tac启动子;lacIq,lacI抑制蛋 白质基因;rrnBT1T2,rrnB基因转录终止位址;EcoRV,限制 EcoRV切割位址;t0,噬菌体的基因转录终止位址; 以及多重选殖位址,其限制切割位置被标示于MCS 框内。 第十二图系质体pTac-Z之架构图。其中含有Apr,胺苄 青霉素抗性基因;Ptac,tac启动子;lacIq,lacI抑制蛋白 质基因;rrnBT1T2,rrnB基因转录终止位址;lacZ,-半乳 糖分解结构基因;HindIII,限制HindIII切割位址 ;NcoI,限制NcoI切割位址;t0,噬菌体的基因转录 终止位址。 第十三图系质体pACYC-A1之架构图。其中含有Cmr,氯 霉素抗性基因;p15A ori,质体p15A的复制源点;PA1,T7 A1 启动子;lacI,lacI抑制蛋白质基因;NruI,限制NruI切 割位址;[BamHI/HindIII],限制BamHI、HindIII切割位址 经质体建构过程中被抹平消除。 第十四图系质体pGFPuv之架构图。其中含有Apr,胺苄 青霉素抗性基因;pUC ori,质体pUC的复制源点;Plac,lac 启动子;GFPuv,水母绿色萤光蛋白质(Aequorea green fluorescent protein)结构基因。 第十五图系一以具有天冬胺酸分解活性的大肠 杆菌生产水母绿色萤光蛋白质之西方墨点图。 |
