转外源基因技术提高黄芪甲苷含量

摘要

本发明公开了一种转外源基因技术提高黄芪甲苷含量的方法。本发明将透明颤菌血红蛋白基因(vgb基因)经改造后，采用酶切结合PCR技术，将vgb基因插入质粒pBI121，获得以35s-CaMV强启动子为启动元件的中间表达载体pBI121-vgb，并转入大肠杆菌DH5α。采用三亲杂交法(pRK2013、DH5α和LBA9402)，获得转vgb基因的发根农杆菌LBA9402-vgb。用其侵染黄芪无菌苗，获得转基因黄芪毛状根，经测定其中黄芪甲苷含量高于未转基因毛状根含量5倍。

主权项

1、一种转外源基因技术提高黄芪甲苷含量的方法，其特征在于该方法包括下列步骤：1)质粒pBI121的提取反应试剂的配制：LB液体培养基；溶液1为50mM葡萄糖，25mMTris-HCl，10mM乙二胺四乙酸，pH8.0；溶液2为0.2MNaOH，1％十二烷基硫酸钠；溶液3为5MKAc60ml，HAc11.5ml，无菌双蒸去离子水28.5ml；酚∶氯仿∶异戊醇25∶24∶1混合液；核糖核酸酶20μg/ml；无水乙醇；70％乙醇；操作程序：取2ml含抗生素的LB液体培养基，加入15ml的通气良好的试管中，然后从转化平板上挑一单菌落，37℃，300rpm，培养过夜；取1.5ml培养物，4℃，12000rpm，离心0.5min，倒去上清液，沉淀加100μl溶液1重新悬浮细菌，剧烈震荡；加200μl溶液2，盖紧盖子，快速颠倒混匀，置冰上；加150μl冰预冷的溶液3，盖紧盖子，颠倒混匀，置冰上3～5min；12000rpm，4℃，离心5min，上清转移；加等体积的酚∶氯仿∶异戊醇混合液，振荡混匀，4℃，12000rpm，离心10min，转移上清液；在上清中加2倍体积乙醇，室温放置2分钟；12000rpm，4℃，离心5min；弃上清，沉淀；加1ml70％乙醇洗涤，4℃，12000rpm，离心10min，沉淀空气干燥10min；加50μl含核糖核酸酶的无菌双蒸去离子水溶解脱氧核糖核酸，储存于-20℃待用；2)双酶切：10×双酶切缓冲液10μl，限制性核酸内切酶XbaI10U/μl3μl，限制性核酸内切酶SacI10U/μl3μl，脱氧核糖核酸10μg，无菌双蒸去离子水37℃水浴1hr，取出75℃灭活内切酶；取5μl电泳鉴定，其余部分酚∶氯仿∶异戊醇25∶24∶1萃取纯化后，加1/10体积的3MNaAc，2倍体积的乙醇沉淀脱氧核糖核酸；静置10min后，12000rpm，4℃，离心10min，沉淀用70％乙醇洗涤两次后晾干约10min，加适量的无菌水溶解，进行连接；3)感受态细菌的制备：从-70℃低温冰箱取出大肠杆菌DH5α，接种于LB平板，37℃培养过夜进行活化，从活化平皿上挑取单菌落，接入5ml不含抗生素的LB液体培养基中，37℃振摇培养过夜250rpm，次日按1％体积比转入新鲜的LB液体培养基中，37℃振摇培养至OD600＝0.3～0.6，在无菌条件下，将50～100ml培养液转入两个预冷的无菌离心管中，冰上静置10min，4℃，4000rpm离心10min，弃去上清液，倒置流尽培养液，加10ml预冷的0.1MCaCl2溶液，重悬浮细菌，冰浴30min，4℃，4000rpm离心10min，弃去上清液，加2ml预冷的0.1MCaCl2溶液，重悬浮细菌，即为感受态细胞；4)引物设计：根据透明颤菌血红蛋白基因序列设计引物，预计片断长度451bp；正向：5′-AAGGATCCATGTTAGACCAGCAAACC-3′反向：5′-ACAAGCTTATTCAACCGCTTGAGC-3′5)质粒与插入片段的连接10×连接缓冲液1μl，透明颤菌血红蛋白基因经双酶切纯化得到的脱氧核糖核酸片断，插入片段和载体pBI121的摩尔比例为2∶1，T4脱氧核糖核酸连接酶5U/μl1μl，无菌双蒸去离子水，16℃水浴过夜，连接液用于转化；6)聚合酶链式反应模板1μl，正向引物5μM2μl，反向引物5μM2μl，10×缓冲液2μl，MgCl225mM1.6μl，脱氧核酸核苷三磷酸10mM0.5μl，脱氧核糖核酸聚合酶3U/μl0.3μl，无菌双蒸去离子水；聚合酶链式反应循环条件：94℃预变性5min；94℃变性30sec，55℃退火30sec，72℃延伸30sec，30个循环；最后72℃延伸5min，反应完毕后，取4μl反应产物上样于1.0％琼脂糖凝胶电泳；7)转化与克隆筛选：取100μl感受态细胞，加4μl步骤5)得到的连接液，冰浴30min后，42℃热激1.5min，冰上冷却1～2min；加SOC培养基800μl，于37℃，180rpm培养1hr；取培养物100μl铺于含50μg/ml卡那霉素的LB平板，37℃恒温培养箱过夜培养，聚合酶链式反应方法筛选携带中间载体pBI121-vgb的大肠杆菌；8)三亲杂交法将透明颤菌血红蛋白基因转入发根农杆菌：接种发根农杆菌LBA9402在含有100μg/ml利福平的YMB固体培养基上，28℃培养至单菌落长出，挑单菌落接种于加100μg/ml利福平的YMB液体培养基，28℃，250rpm培养40hr，按1％的接种比例将农杆菌接种于YMB液体培养基中，28℃，250rpm培养至OD600为0.5，接种含有协助质粒的大肠杆菌pRK2013以及携带中间载体pBI121-vgb的大肠杆菌于含50μg/ml卡那霉素固体LB培养基上，37℃，300rpm培养过夜，当单菌落长出后，分别挑单菌接种于含50μg/ml卡那霉素液体LB培养基中，37℃，300rpm培养过夜，按1％的接种比例将协助菌和含中间载体的细菌接种于LB液体培养基中，37℃，300rpm培养至OD600为0.5，将三种菌等体积混匀后，取50μl接种于直径2cm的无菌滤纸上置于YMB固体培养基上，25℃培养一天，用适量无菌水冲洗滤纸片，收集洗出的菌液，均匀涂布于含有100μg/ml利福平，50μg/ml卡那霉素的YMB固体培养基上，25℃培养四天后出现单菌落，挑单菌落进行聚合酶链式反应鉴定，阳性菌落接种于含有100μg/ml利福平，50μg/ml卡那霉素的YMB液体培养基，28℃，250rpm，培养过夜，再对菌液提取质粒脱氧核糖核酸进行聚合酶链式反应鉴定，确定的阳性菌LBA9402-vgb；9)转透明颤菌血红蛋白基因发根农杆菌LBA9402-vgb侵染黄芪无菌苗诱导毛状根接种发根农杆菌LBA9402-vgb在含有100μg/ml利福平和50μg/ml卡那霉素的YMB固体培养基上，28℃培养至单菌落长出，挑单菌落接种于加100μg/ml利福平和50μg/ml卡那霉素的YMB液体培养基，28℃，250rpm，培养40hr，按1％的接种比例将农杆菌接种于YMB液体培养基中，28℃，250rpm培养过夜，加适量乙酰丁香酮至终浓度50μM，再培养一天，无菌条件下，切取黄芪无菌苗的茎和叶片，在切口处接种发根农杆菌LBA9402-vgb菌液OD600＝0.5，然后转移至MSOH固体培养基，25℃、黑暗条件下培养2天，无菌水洗涤外植体4～5次后，转移至含500mg/L凯福隆的固体MSOH培养基，25℃、黑暗条件下培养诱导产生毛状根。