破伤风毒素T细胞表位多肽与人B淋巴细胞刺激因子融合蛋白及其制备

摘要

本发明公开了破伤风毒素T细胞表位肽与人B淋巴细胞刺激及因子融合蛋白及制备方法，TT表位肽-QYIKANSKFIGITE-(谷氨酰胺-酪氨酸-异亮氨酸-赖氨酸-丙氨酸-天冬酰胺-丝氨酸-赖氨酸-苯丙氨酸-异亮氨酸-甘氨酸-异亮氨酸-苏氨酸-谷氨酸)可以刺激机体的CD4⁺T细胞反应，促进机体的体液免疫水平。采用分步克隆，构建TT与BLyS的融合基因，并在大肠杆菌中获得高效表达。通过TT与BLyS融合，克服了机体的免疫耐受，使得机体发生高水平的体液免疫反应，产生的BLyS多克隆中和抗体可以中和体内的高水平的天然BLyS的B淋巴细胞刺激活性，从而发挥抗自身免疫性疾病的作用。

主权项

1.一种破伤风毒素T细胞表位多肽与人B淋巴细胞刺激因子融合蛋白TT-BLyS的制备方法，其特征在于按以下步骤进行：1)重组质粒的构建①TT表位肽基因的克隆编码TT830-843的在这对寡核苷酸片段的5’端引入了EcoRI酶切位点，3’端引入了BamHI酶切位点：S15’-AATTCATGCAGTACATCAAAGCTAACTCCAAATTCATCGGTATCACTGAAG-3’S25’-GATCCTTCAGTGATACCGATGAATTTGGAGTTAGCTTTGATGTACTGCATG-3’取等量S1和S2，煮沸5分钟，自然冷却至室温，进行退火；克隆载体pGEM-3Zf(-)经EcoRI和BamHI双酶切并回收大片段；TT的退火产物与载体酶切后回收的大片段经T4连接酶进行连接反应；连接产物转化感受态细胞DH5α，挑取单克隆培养过夜，提取质粒，进行双酶切和DNA序列测定进行鉴定；②人B淋巴细胞刺激因子和TT融合基因克隆载体的构建通过PCR反应获得人BLyS基因，同时将BamHI酶切位点引入5’端引物，PstI酶切位点引入3’端引物；引物序列如下：P1(5’端引物31nt)5’-GCGGGATCCATGGCCGTTCAGGGTCCAGAAG-3’P2(3’端引物31nt)5’-GCGCTGCAGTCACAGCAGTTTCAATGCACCA-3’对人白细胞cDNA文库进行PCR扩增；PCR扩增反应管的配制均在冰浴中进行，PCR反应体系为：不含有Mg2+的10×PCRbuffer5μL，2.5mmol/LdNTP4μL，引物各1μL，25mmol/LMgCl23μL，cDNA模板1μL，TaqDNA聚合酶1μL，加水至总体积50μL；PCR反应条件：94℃1min，52℃45s，72℃1min，共30次循环；最后，72℃延伸10min；PCR产物进行0.8％琼脂糖凝胶电泳，可见预期大小的DNA片段；质粒pGEM-3Zf(-)-TT经BamHI和PstI双酶切后回收大片段，回收的片段与上述的PCR产物经同样双酶切的回收产物进行连接反应；连接产物转化感受态细胞DH5α，挑取单克隆培养过夜，提取质粒，经酶切鉴定获得预期大小的插入片段，进行测序，结果与预期一致；2)原核表达载体的构建及重组蛋白表达质粒pGEM-3Zf(-)-TT-BLyS经EcoRI和PstI双酶切后回收小片段，原核非融合表达载体pKKH也经上述同样的双酶切后回收大片段，两者进行连接反应；连接产物转化感受态细胞DH5α，挑取单克隆培养过夜，提取质粒，酶切鉴定正确的质粒命名为pKKH-TT-BLyS，将含有重组质粒pKKH-TT-BLyS的大肠杆菌DH5α于37℃置入LB培养基中活化振摇培养过夜，次日清晨，按1∶100的比例接种于LB培养基中后，继续37℃培养3h至对数生长后期，OD650nm＝0.4时，加入1mMIPTG，培养4h，收集菌体；超声裂菌后，离心收集包涵体；3)表达产物的鉴定对表达产物的鉴定采用Westernblot鉴定，检测其与BLyS单抗的反应特异性，步骤如下：①pKKH-TT-BLyS/DH5α诱导后裂菌产物进行SDS-PAGE；②电泳分离后，按照Bio-Rad产品说明，将凝胶靠近阴极一侧、硝酸纤维素膜靠近阳极一侧，在预冷的转移缓冲液中100V恒压1小时电泳，将蛋白转移至NC膜上；③电泳结束后，取出NC膜，洗涤液TBST清洗后浸入含有2％BSA的TBST中37℃1小时，TBST室温洗3次，5min/次，加入羊抗人BLyS抗体，37℃孵育1小时，TBST洗3次，加入兔抗羊IgG-AP，37℃孵育1小时，TBST洗3次，再用TBS洗3次，NC膜浸入显色液中，室温避光显色适当时间，蒸馏水冲洗终止反应；观察诱导产物与BLyS抗体的特异性反应；同时，对纯化产物进行N-末端氨基酸测序，方法为：纯化的蛋白质SDS-PAGE电泳后转移至PVDF膜上，R-250染色，脱色后用Edman降解法在492型ProciseTMcLC蛋白测序仪上分析N端氨基酸序列；4)重组蛋白的纯化每1克菌体加5ml裂菌缓冲液，两者混合后的体积为V，将菌体重悬，裂菌缓冲液的配方为：0.1mol/LTris，pH7.0；1mmol/LEDTA，并加入1.5mg/mL的溶菌酶，室温下搅拌30分钟；然后加入10μg/mL的DNaseI和20mmol/L的MgCl2，继续作用30分钟；加入终浓度为1.5mol/LNaCl、2％TritonX-100和3V的20mmol/LEDTA，4℃搅拌30分钟，4℃条件下离心，12000rpm，20min，收集沉淀用3V的4mol/LUrea、2％TritonX-100、20mol/LEDTA、0.1mol/LTrispH8.0室温洗涤30分钟，沉淀再用8V的20mol/LEDTA、0.1mol/LTrispH7.0，室温洗涤30分钟，离心收集包涵体；包涵体用7M盐酸胍、10mg/LDTT进行溶解，离心后上清用Sephacryl300进行凝胶过滤层析，洗脱液为7M盐酸胍，收集洗脱液，分别对4M尿素、2M尿素和水进行透析复性，并对纯化产物进行质量鉴定。