用诱导培养基链球菌制备磷酸甘油氧化酶的方法

摘要

本发明是用诱导培养基链球菌制备磷酸甘油氧化酶的方法。培养基组分及培养条件：斜面诱导培养基由酵母提取物、蛋白胨、葡萄糖、磷酸氢二钾、甘油、琼脂、硫酸镁、氯化锰、氯化钠、pH6.8的混合盐溶液构成；种子培养基由酵母提取物、蛋白胨、葡萄糖、磷酸氢二钾、甘油、硫酸镁、氯化锰、氯化钠、pH6.8的混合盐溶液构成；发酵培养基由酵母提取物、蛋白胨、磷酸氢二钾、甘油、硫酸镁、氯化锰、氯化钠、pH6.8的混合盐溶液构成。菌株经斜面培养，种子培养，旋转摇床发酵培养，再进行放大培养后收集菌体，采用聚乙二醇－硫酸铵双水相萃取和两步层析纯化即得到磷酸甘油氧化酶。

主权项

1、用诱导培养基链球菌制备磷酸甘油氧化酶的方法，将利用分离得到的链球菌置于含有甘油的诱导培养基中培养，经分离纯化得到甘油磷酸氧化酶，其特征在于一、链球菌株的培养基组成重量百分比斜面诱导培养基：酵母提取物0.5-2.5，蛋白胨1.0-2.0，葡萄糖0.05-0.5，磷酸氢二钾0.2-0.8，甘油0.1-0.5，琼脂1.5-3.0，硫酸镁4，氯化锰1，氯化钠20，pH6.8的混合盐溶液0.1-0.4毫升；种子培养基：酵母提取物0.5-2.5，蛋白胨1.0-2.0，葡萄糖0.1-0.8，磷酸氢二钾0.2-0.8，甘油0.1-0.5，硫酸镁4，氯化锰1，氯化钠20，pH6.8的混合盐溶液0.1-0.4毫升；发酵培养基：酵母提取物0.5-2.5，蛋白胨1.0-2.0，磷酸氢二钾0.5-2.0，甘油0.1-0.5，硫酸镁4，氯化锰1，氯化钠20，pH6.8的混合盐溶液0.1-0.4毫升；二、菌株的培养条件：菌株在25-32℃斜面培养基上培养18-28小时后，接入种子培养基，25-32℃振荡，200转/分钟，培养18-24小时，将种子液按5-10％比例接入发酵培养基中，25-32℃，200转/分钟，旋转摇床上培养18-28小时；三、将上述条件下培养的菌液按照以下条件进行分离纯化聚乙二醇-硫酸铵双水相体系萃取：在4℃，将发酵液10,000转/分钟，离心10分钟，收集菌体，用20毫摩尔pH7.5三羟基甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液洗涤菌体3次，按1克菌体加入4毫升pH7.5三羟基甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液的比例悬浮菌体，在低温，50kHz，600W超声波破碎，破碎3次，每次破碎3秒，间隙2秒，5分钟/次，持续15分钟，破碎液于4℃下，12,000转/分钟，离心5分钟，收集破碎液上清，测定蛋白质含量。然后进行双水相体系萃取。双水相组成：在16.5％聚乙二醇2000，13.2％(NH4)2SO4，pH7.5，磷酸甘油氧化酶在上相的收率为90％，分配系数为1.0，纯化倍数为7倍；二乙基氨基乙基-琼脂糖凝胶FF柱层析：用pH7 50.0毫摩尔三羟基甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液充分平衡柱，上样，用同样缓冲液洗杂蛋白，然后以0～0.5摩尔NaCl，pH7 50毫摩尔三羟基甲基氨基甲烷-盐酸进行直线梯度洗脱，分步收集，通过检测，收集酶活性峰部分；黄素腺嘌呤二核苷酸-琼脂糖凝胶亲合柱层析：层析柱床体积5.0毫升，用3毫摩尔α-巯基乙醇的pH7 50.0毫摩尔硼酸缓冲液充分平衡，样品上柱后，用含上述平衡缓冲液充分洗脱杂蛋白，然后用含黄素腺嘌呤二核苷酸的pH7 50.0毫摩尔硼酸缓冲液洗脱，收集酶活性峰部分。