| 主权项 |
1.一种经单离之核酸分子,其可控制花型及/或花开 寿命,该核酸分子系选自由编码PeMADS6蛋白质之分 子及编码PeMADS6蛋白质之反转录股分子所组成之群 ,其中PeMADS6具有如序列辨识编号1所示之序列。 2.根据申请专利范围第1项之核酸分子,其系用以于 兰花中控制花型及/或花开寿命。 3.根据申请专利范围第2项之核酸分子,其系用以于 蝴蝶兰中控制花型及/或花开寿命。 4.根据申请专利范围第1项之核酸分子,其系用以于 阿拉伯芥中控制花型及/或花开寿命。 5.根据申请专利范围第1项之核酸分子,其系用于控 制花萼之发育。 6.根据申请专利范围第1项之核酸分子,其系用于控 制花瓣之发育。 7.根据申请专利范围第1项之核酸分子,其系用于控 制子房之发育。 8.根据申请专利范围第1项之核酸分子,其系用于抑 制胚珠之发育。 9.一种载体,其载有如申请专利范围第1至8项任何 一项之核酸分子。 10.根据申请专利范围第9项之载体,其系可于植物 体中表现之一穿梭载体。 11.根据申请专利范围第9项之载体,其包含一可诱 导之启动子。 12.一种套组,其可控制花型及/或花开寿命,其包含 如申请专利范围第9项之载体。 13.根据申请专利范围第12项之套组,其中该载体系 可于植物体中表现之一穿梭载体。 14.根据申请专利范围第12项之套组,其中该载体包 含一可诱导之启动子。 15.一种细胞,其包含如申请专利范围第9项之载体 。 16.根据申请专利范围第15项之细胞,其中该载体系 可于植物体中表现之一穿梭载体。 17.根据申请专利范围第15项之细胞,其中包含一可 诱导之启动子。 18.根据申请专利范围第15项之细胞,其中该细胞为 一原核细胞。 19.根据申请专利范围第15项之细胞,其中该细胞为 一兰科植物细胞。 20.根据申请专利范围第15项之细胞,其中该细胞为 一蝴蝶兰细胞。 21.根据申请专利范围第15项之细胞,其中该细胞为 一阿拉伯芥细胞。 22.一种拟原球体(protocorn-like body),其包含如申请专 利范围第1至8项任何一项之核酸分子。 23.一种制造转殖植物之方法,其步骤包含: (a)将具如申请专利范围第1至8项任何一项之核酸 分子导引至一植物细胞以获得一植物转形细胞;及 (b)自步骤(a)中之植物转形细胞再生制造该转殖植 物。 24.根据申请专利范围第23项之方法,其中该植物为 兰科植物。 25.根据申请专利范围第24项之方法,其中该植物蝴 蝶兰。 26.根据申请专利范围第23项之方法,其中该植物为 阿拉伯芥。 27.根据申请专利范围第23项之方法,其中该植物细 胞系源自一拟原球体。 28.根据申请专利范围第23项之方法,其中步骤(a)系 以一基因枪(gene gun)将该核酸分子导引至该植物细 胞。 29.一种制造植物转形细胞之方法,其系将如申请专 利范围第1至8项任何一项之核酸分子导引至一植 物细胞中,以获得该植物转形细胞。 30.根据申请专利范围第29项之方法,其中该植物细 胞为衍生自兰科植物。 31.根据申请专利范围第30项之方法,其中该植物细 胞为衍生自蝴蝶兰。 32.根据申请专利范围第29项之方法,其中该植物细 胞为衍生自阿拉伯芥。 33.根据申请专利范围第29项之方法,其中该植物细 胞系源自一拟原球体。 34.根据申请专利范围第29项之方法,其系以一基因 枪(gene gun)将该核酸分子导引至该兰科植物细胞。 35.一种用以控制花型及/或花开寿命之蛋白质,其 系由根据申请专利范围第1至8项任何一项之核酸 分子所编码。 36.根据申请专利范围第35项之蛋白质,其系具有如 序列辨识编号1之PeMADS6蛋白质。 37.一种于控制花型及/或花开寿命之方法,其系改 变一植物体内如申请专利范围第35项之蛋白质表 现量,以控制花型及/或花开寿命。 38.根据申请专利范围第37项之方法,其改变包含增 加、减少及去除该蛋白质。 39.根据申请专利范围第37项之方法,其改变包含于 该植物体之至少一细胞内增加或减少编码该蛋白 质之核酸分子之套数。 40.根据申请专利范围第39项之方法,其系以一基因 枪将该核酸分子导引至该细胞。 41.根据申请专利范围第40项之方法,其中该细胞系 源自一拟原球体。 42.根据申请专利范围第39项之方法,其改变包含导 引该核酸分子之反转译股(anti-sense strand)于该细胞 内。 图式简单说明: 图1A表示野生种之桃红蝴蝶兰(Phalaenopsis equestris) 花型;图1B表示突变种之桃红蝴蝶兰花型;及图1C表 示花苞发育之时期。 图2表示PeMADS6蛋白质与类GLO及类DEF基因产物之序 列比对分析图。此比对分析图系由电脑程式PILEUP 分析,并以PRETTYBOX显示,其中相同序列之部分以黑 色框反白字标示;类似序列之部分以灰色框标示; 不同序列之部分以白色框黑色字标示;缺口之部分 以点标示;及无胺基酸残基之之部分则以「~」标 示。图中「MADS-DOMAIN」表示MADS区域;「I-DOMAIN」表 示介中区域;「K-DOMAIN」表示类角蛋白区域;及「C- DOMAIN」表示C端区域。用于比较之OSMADS4(AAC05723)及 OSMADS2(AAB52709)为来自水稻(Oryza sativa);ZMM16(CAC33848) 、ZMM18(CAC33849)及ZMM29(CAC33850)为来自玉米(Zea mays); DEF(S12378)及GLO(CAA48725)为来自金鱼草(Antirrhium majus); PI(BAA06465)及AP3(A42059)为来自阿拉伯芥(Arabidopsis thaliana);且PeMADS6则来自桃红蝴蝶兰。 图3表示B基因之MADS-box基因家族中,DEF、GLO及GGM2次 家族之演化树图。已发表之MADS-box蛋白质序列系 取自基因资料库(GenBank database)(DAL11[AAF18372]、DAL13[ AAF18376]、GGM2[CAB44448]、OSMADS2[AAB52709]、ZMM16[CAC33848] 、ZMM18[CAC33849]、ZMM29[CAC33850]、OSMADS4[AAC05723]、HPI2[ AAD22494]、HPI1[AAD22493]、ORCPI[BAC22579]、LRGLOA[BAB91551] 、LRGLOB[BAB91552]、TGGLO[BAC75972]、SMPI[AAF73941]、NTGLO[ CAA48142]、FBP1[AAA33731]、GLO[S28062]、PMADS2[CAA49568]、 GGLO1[CAA08804]、SLM2[CAA56656]、EGM2[AAC78283]、PI[BAA06465] 、PeMADS2[AY378149]、PeMADS3[AY378150]、PeMADS4[AY378147]、 PeMADS5[AY378148]、DEF[S12378]、AP3[A42095])此演化分析系 采邻近参与演算法(neighbor-joining algorithm)进行,以B 基因蛋白质的旁支系GMM13(Becker, A.等人(2000).MADS-box gene diversity in seed plants 300 million years ago. Mol. Biol. Evol. 17, 1425-1434)为演化树之根,图中亦于主要的结 点上指出自1000个复制(replicates)之启动値(bootstrap values),蛋白质名称后括号中之种名为最具代表性 者,PeMADS6则以 方格重点提示,单子叶植物之同源基因群则在右侧 以括弧标示。 图4表示桃红蝴蝶兰中PeMAD6基因的南方墨点分析图 。其中DNA凝胶墨点包含分别以Bgl II(第1、5行)、 Hind III(第2、7行)、EcoR V(第3行)及EcoR I(第4、6行)处 理之10 g基因体DNA,并于严格之状态下,与PeMADS6基 因之3'端特异区域(A)及IK区域(B)探针杂合。图中之 基因名标示于上方,而DNA之分子长度标记(kb)则标 示于左方。 图5A表示PeMADS6基因于不同之花苞发育时期及于不 同兰花组织中之表现图。图中之基因名标示于左 。行一至四中,每一行包含时期I至时期IV花苞之10 g全部RNA;行五为小花梗;行六为苗芽(shoots);行七 为叶;及行八为根。B及C以北方墨点分析PeMADS6基因 于野生种(图B)及突变种(图C)不同花器官中之表现, 每一行包含与3'特异区域探针杂交之10 g全部RNA, 核糖体RNA代表全部RNA之量,其中RNA系取自花萼(图5B 及5C,行一)、花瓣(图5B,行二)、似唇瓣之花瓣(图5C, 行二)、唇瓣(图5B及5C,行三)、花粉块(图5B,行四)、 及蕊柱(图5B,行五、图5C,行四)。 图6表示PeMADS6之mRNA于自然枯萎过程及授粉作用后 在花及小花梗中之累积;A及B表示PeMADS6之mRNA于自 然枯萎过程花(A)及小花梗(B)中之累积;每一行包含 组织中10 g全部RNA(第0天):图6A及6B,行一;花全开 之时(第4天):图6A及6B,行二;花全开之四天后(第8天) :图6A及6B,行三;花全开之八天后及枯萎日:图6A及6B, 行四。C及D表示PeMADS6之mRNA于授粉作用后花(C)及小 花梗(D)中之累积;每一行包含组织中10 g全部RNA; 授粉作用后1小时:图6C及6D,行一;授粉作用后6小时: 图6C及6D,行二;授粉作用后12小时:图6C及6D,行三;授 粉作用后1天:图6C及6D,行四;授粉作用后2天:图6C及6 D,行五;授粉作用后4天:图6C及6D,行六;每一墨点包 含与3'特异区域探针之杂交,核糖体RNA代表全部RNA 之量。 图7表示PeMADS6基因转录物在发育中之花苞纵向切 片原位定位之结果,切片系以3'特异区域RNA探针(A 、F、I)或3'特异区域RNA反转录股探针(B、C、D、E、 G、H、J)之杂交。其中图B及C系侦测花序分生组织 及花原基中之PeMADS6转录物(放大倍率x100);图D及E进 一步侦测花萼、花瓣、唇瓣原基及早期花发育中 可见之整个发育中之花苞(放大倍率x100);图G、H及I 侦测PeMADS6持续于花萼、花瓣、唇瓣及蕊柱(放大 倍率x50)之表现;b:苞片;im:花序分生组织;fp:花原基; Sp:花萼原基;pp:花瓣原基;lp:唇瓣原基;s:花萼;p:花 瓣;l:唇瓣;pl:花粉块;c:蕊柱。 图8表示野生种阿拉伯芥及35S:PeMADS6转殖阿拉伯芥 之表型分析结果。野生(A、C、E、G、I、K)花器官 之表型系与35S:PeMADS6转殖植物(B、D、F、H、J、L)比 较。扫瞄式电子显微镜图系示于图C至L。A:野生阿 拉伯芥花;B:具有延伸花萼之35S:PeMADS6转殖阿拉伯 芥;C:野生阿拉伯芥花之花萼近轴表皮细胞型态,短 条=60 m;D:于近轴侧具有花瓣化边缘(箭头指处)之 转殖花萼阿拉伯芥花,短条=60 m;E:野生阿拉伯芥 花萼近轴表皮末端,短条=36 m;F;于花瓣化边缘之 转殖花萼细胞型态末端,短条=36 m;G:野生花萼之 近轴表皮细胞型态,短条=90 m;H:35S:PeMADS6转殖花 萼之近轴表皮细胞型态,短条=90 m;I:野生花萼近 轴表皮之末端,短条=36 m;J:转殖花萼表皮之末端, 短条=36 m;K:野生花瓣表皮细胞型态,短条=36 m;L :35S:PeMADS6转殖花瓣近轴表皮细胞型态,短条=36 m 。 图9表示过度表现PeMADS6之转殖基因植物之花开寿 命表型;A:开花前之成熟花苞;B:开花日之花;C:开花 后第二天之花;D:开花后第三天之花;E:开花后第三 天之花。 |
