人甲状旁腺激素与人血清白蛋白的融合蛋白的制备方法及产品

摘要

人甲状旁腺激素(PTH)与人血清白蛋白(HSA)的融合蛋白的制备方法及产品，属于长效重组融合蛋白药物技术领域。本发明利用重叠PCR技术，将HAS cDNA和PTH cDNA进行拼接，中间不加入任何连接肽，得到的PTH－HSA cDNA融合基因被整合到宿主的染色体中，在宿主系统中进行表达。本发明的融合蛋白包括与人血清白蛋白至少85％序列同源的第一区和与人甲状旁腺激素至少85％序列同源的第二区。该融合蛋白可以在不改变融合蛋白特性的前提下，进行个别氨基酸残基的取代、缺失或加入。本发明的融合蛋白在保持了人甲状旁腺激素生理特性的基础上，延长其在体内的半衰期，改善其溶解度，在药学领域有良好的应用前景。

主权项

1、人甲状旁腺激素与人血清白蛋白的融合蛋白的制备方法，其特征是从新鲜人甲状旁腺组织中分离单核甲状旁腺细胞，刺激培养，提取RNA；通过RT-PCR反转录得到PTH cDNA；通过PCR从人胎肝cDNA文库中扩增获得HSA cDNA；利用重叠PCR技术，连接HSA cDNA和PTH cDNA，中间不加入任何连接肽，得到的PTH-HAS cDNA融合基因插入到克隆载体，PTH-HAS cDNA融合基因在宿主系统中进行表达，PTH-HAS cDNA融合基因被整合到宿主的染色体中；(1)PTH cDNA的克隆：以RT-PCR反转录得到的PTH cDNA第一链为模板，通过PCR扩增出PTHcDNA，所用的引物如下：p1：5’CGGAATTCATGACCCCCCTGGGCCCTGC-3’p2：5’CGGCGGCCGCTCAGGGCTGGGCAAGGTGGC-3’PCR方法如下：50μl的反应体系中加入：10μmol/L的p1和p2的引物各1.5μl，2mmol/L的dNTP 5μl，10×pfu Buffer 5μl，5U/μl的pfu DNA聚合酶0.5μl，PTHcDNA第一链1μg，加双蒸水补齐50μl，PCR条件为：95℃变性10分钟，94℃变性1分钟，65℃退火1分钟，72℃延伸90秒，循环35次；通过琼脂糖凝胶电泳分析反应产物，在加样泳道出现目标条带，用PCR片段胶回收试剂盒纯化出0.27kb的目标片段，纯化好的目标片段和载体pBluescriptII KS(+)分别经EcoRI和HindIII双酶切；琼脂糖凝胶电泳纯化，用PCR片段胶回收试剂盒回收，用T4连接酶连接两酶切后纯化好的片段；连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，转化物涂布于含有100μg/ml氨苄青霉素的LB琼脂平板，37℃培养过夜；随机挑取5个单菌落，接种于20ml含100μg/ml氨苄青霉素的LB培养基中37℃培养过夜，提取质粒；通过PCR，及EcoRI和HindIII双酶切，琼脂糖凝胶电泳鉴定阳性克隆，并对重组质粒EcoRI和HindIII双酶切位点间区域进行DNA测序；阳性重组子保存在含有15％甘油的LB中，冻存于-80℃；重组质粒命名为pBlue-PTH，阳性重组子命名为DH5α/pBlue-PTH；(2)HSA cDNA的克隆：利用PCR从人胎肝cDNA文库中扩增出HSA cDNA，所用的引物为：PH1：5’AGGTCGACGATGCACACAAGAGTGAGGTTGCTC-3’PH2：5’-GCCAAGCTTTTATAAGCCTAAGGCAGCTTGACTT-3’PCR方法如下：50μl的反应体系中加入：10μmol/L的PH1和PH2的引物各1.5μl，2mmol/L的dNTP 5μl，10×pfu Buffer 1μl，5U/μl的pfu DNA聚合酶0.5μl，人胎肝cDNA文库1μg，加双蒸水补齐50μl；PCR条件为：95℃变性5分钟，94℃变性1分钟，60℃退火1分钟，72℃延伸90秒，循环30次；通过琼脂糖凝胶电泳分析反应产物，在加样泳道出现目标条带，用PCR片段胶回收试剂盒纯化出1.8kb的目标片段，纯化好的目标片段和载体pBluescriptII KS(+)分别经SalI和HindIII双酶切；琼脂糖凝胶电泳纯化，用PCR片段胶回收试剂盒回收，用T4连接酶连接两双酶切后纯化好的片段；连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，转化物涂布于含有X-gal、IPTG和100μg/ml氨苄青霉素的LB琼脂平板，37℃培养过夜；挑取白色菌落，接种于20ml含100μg/ml氨苄青霉素的LB培养基中37℃培养过夜，提取质粒；通过PCR，及SalI和HindIII双酶切，琼脂糖凝胶电泳鉴定阳性克隆，并对重组质粒SalI和HindIII双酶切位点间区域进行DNA测序；阳性重组子保存在含有20％甘油的LB中，冻存于-80℃；重组质粒命名为pBlue-HSA，阳性重组子命名为DH5α/pBlue-HAS；(3)PTH cDNA和HSA cDNA融合基因的克隆：HSA cDNA的PCR扩增，所用引物如下：P1：5’-CGGAATTCAAAAGAGATGCACACAAGAGTGAGGTTGCTCATCG-3’P2：5’-CAGGGGGGTGCCTAAGGCAGCTTGACTTGCAGCAACAA-3’PCR方法如下：50μl的反应体系中加入：10μmol/L的引物P1和P2各1.5μl，2mmol/L的dNTP 5μl，10×pfu Buffer 5μl，5U/μl的pfu DNA聚合酶0.5μl，pBlue-HSA 1μg，加双蒸水补齐50μl；PCR条件为：95℃变性5分钟，65℃退火1分钟，72℃延伸4分钟，94℃变性1分钟，循环30次；PTHcDNA的PCR扩增，所用引物如下：P3：5’-CTGCCTTAGGCACCCCCCTGGGCCCTG-3’P4：5’-CGGCGGCCGCTCAGGGCTGGGCAAGGTGGCGTAGAAC-3’PCR方法如下：50μl的反应体系中加入：10μmol/L的P3和P4的引物各1.5μl，2mmol/L的dNTP 5μl，10×pfu Buffer 5μl，5U/μl的pfu DNA聚合酶0.5μl，pBlue-PTH 1μg，加双蒸水补齐50μl；PCR条件为：95℃变性5分钟，66.5℃退火1分钟，72℃延伸90秒，94℃变性1分钟，循环30次；利用重叠PCR融合PTH cDNA和HSA cDNA：将PTH的PCR扩增产物和HSA的PCR扩增产物分别稀释10倍，再以4∶6体积比混合后作为模板，于50μl的反应体系中加入：2mmol/L的dNTP 5μl，10×pfuBuffer 5μl，5U/μl的pfu DNA聚合酶0.5μl，混合好的模板1μl，加双蒸水补齐50μl；PCR条件为：95℃变性5分钟，60℃退火1分钟，72℃延伸4分钟，94℃变性1分钟，循环30次；通过琼脂糖凝胶电泳分析反应产物，在加样泳道出现目标条带，用PCR片段胶回收试剂盒纯化出2kb的目标条带，纯化好的目标片段和载体pBluescript IIKS(+)经EcoRI和HindIII双酶切；琼脂糖凝胶电泳纯化，用PCR片段胶回收试剂盒回收，取双酶切后纯化好的PTH-HSA片段5μl，pBluescript IIKS(+)5μl，加入2μl 10×ligation buffer，0.4μl T4连接酶，加双蒸水补齐20μl，15℃反应过夜；连接产物转化大肠杆菌XL-1Blue感受态细胞，转化物涂布于含有100μg/ml氨苄青霉素的LB琼脂平板，37℃培养过夜；随机挑取5个单菌落，接种于20ml含100μg/ml氨苄青霉素的LB培养基中37℃培养过夜，提取质粒；通过PCR，及EcoRI和HindIII双酶切，琼脂糖凝胶电泳鉴定阳性克隆，并对重组质粒EcoRI和HindIII双酶切位点间区域进行DNA测序；阳性重组子保存在含有15％甘油的LB中，冻存于-80℃；融合基因命名为PTH-HSA，重组质粒命名为pBlue-PTH-HAS，含重组质粒的重组大肠杆菌命名为XL-1/pBlue-HSA-PTH；(4)融合蛋白HSA-PTH的重组酵母构建：取一支冻存的XL-1/pBlue-HSA-PTH，接种到20ml含100μg/ml氨苄青霉素的LB培养基中37℃培养过夜，提取质粒，提取的质粒pBlue-PTH-HSA和酵母表达载体pPIC9K，分别经EcoRI和HindIII双酶切，琼脂糖凝胶电泳纯化，用PCR片段胶回收试剂盒回收，用T4连接酶连接两双酶切后纯化好的片段；连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，转化物涂布于含100μg/ml氨苄青霉素的LB琼脂平板，37℃培养过夜；挑取长出菌落，接种于20ml含100μg/ml氨苄青霉素的LB培养基中37℃培养过夜，提取质粒；通过PCR，及EcoRI和HindIII双酶切，琼脂糖凝胶电泳鉴定阳性克隆，阳性重组子保存在含有15％甘油的LB中，冻存于-80℃；重组质粒命名为pPIC9K-PTH-HSA，阳性重组子命名为DH5α/pPIC9K-PTH-HAS；提取DH5α/pPIC9K-PTH-HSA中的质粒，经SalI酶切后，电击转化毕赤酵母KM71，提取重组毕赤酵母基因组DNA，通过PCR，琼脂糖凝胶电泳鉴定，阳性重组子命名为KM71/pPIC9K-PTH-HSA；(5)融合蛋白PTH-HSA的表达：将KM71/pPIC9K-PTH-HSA接种至装有100ml BMGY的500ml三角瓶中，300rpm，29℃培养至A600nm为2～6，离心收集菌体，将收集到的菌体接种至装有20ml BMMY的100ml三角瓶中，每24小时补加一次甲醇至终浓度0.5％，诱导3天，离心收集上清，用酶标法测定上清液中的融合蛋白PTH-HAS的含量，进行SDS-PAGE验证，Western杂交鉴定融合蛋白PTH-HSA分子的PTH免疫源性。