| 主权项 |
1.一种制造尘过敏原的方法,其中该尘过敏原 系选自由Der p 5和Der p 2过敏原所组成之群,该方法 包括下列步骤: (a)建构一载体,该载体包含编码尘过敏原之DNA序 列,该DNA序列系操作性连接至一植物专一性之启动 子,该载体系选自由矮南瓜黄化嵌纹病毒(ZYMV)和菸 草嵌纹病毒(TMV)所组成之群;该植物专一之启动子 为花椰菜花叶病毒35S启动子; (b)以步骤(a)之载体转型一植物细胞或组织;以及 (c)从步骤(b)的植物细胞或组织中获得该尘过敏 原。 2.根据申请专利范围第1项之方法,其中该尘过敏 原为Der p 5过敏原。 3.根据申请专利范围第1项之方法,其中该尘进一 步包括内质网(ER)滞留信号。 4.根据申请专利范围第1项之方法,其中该载体是经 过修饰的植物病毒载体。 5.根据申请专利范围第1项之方法,其中该载体进一 步包括可选择标记基因。 6.根据申请专利范围第1项之方法,其中该植物的至 少一部分是可食用的。 7.根据申请专利范围第1项之方法,其中该植物系选 自由菸草、马铃薯和意大利瓜、番茄、莴苣、白 葡萄、香蕉、稻米、萝卜、胡萝卜、苹果、大豆 、玉米和浆果所组成之群。 8.根据申请专利范围第7项之方法,其中该植物系选 自由马铃薯的背纳贝克变种、菸草和矮南瓜所组 成之群。 9.根据申请专利范围第1项之方法,其中在步骤(b)中 藉着土壤杆菌调解之基因转移、直接DNA摄入或植 物病毒感染步骤,以转型该植物细胞和组织。 10.根据申请专利范围第1项之方法,更进一步包括 在步骤(c)之前,从步骤(b)之植物细胞或组织中,再 生基因转殖植物的步骤。 11.根据申请专利范围第1项之方法,其中以基因转 殖植物本身、植物的一部分、果实、叶片、茎、 块茎、种子或其萃取物之形式,提供该尘过敏原 。 12.一种制造用于治疗过敏之医药组合物的方法,该 医药组合物包括尘过敏原,该尘过敏原系选自 由Der p 5和Der p 2过敏原所组成之群,其中该尘过 敏原系由包括下列步骤之方法所制备: (a)建构一载体,该载体包含编码尘过敏原之DNA序 列,该DNA序列系操作性连接至一植物专一性之启动 子,该载体系选自由矮南瓜黄化嵌纹病毒(ZYMV)和菸 草嵌纹病毒(TMV)所组成之群;该植物专一之启动子 为花椰菜花叶病毒35S启动子; (b)以步骤(a)之载体转型一植物细胞或组织;以及 (c)从步骤(b)的植物细胞或组织中获得该尘过敏 原。 13.根据申请专利范围第12项之方法,其中该尘过 敏原为Der p 5过敏原。 14.根据申请专利范围第12项之方法,其中该尘进 一步包括内质网(ER)滞留信号。 15.根据申请专利范围第12项之方法,其中该载体是 经过修饰的植物病毒载体。 16.根据申请专利范围第12项之方法,其中该载体进 一步更包括可选择标记基因。 17.根据申请专利范围第12项之方法,其中该植物的 至少一部分是可食用的。 18.根据申请专利范围第12项之方法,其中该植物系 选自由菸草、马铃薯和意大利瓜、番茄、莴苣、 白葡萄、香蕉、稻米、萝卜、胡萝卜、苹果、大 豆、玉米和浆果所组成之群。 19.根据申请专利范围第18项之方法,其中该植物系 选自由马铃薯的背纳贝克变种、菸草和矮南瓜所 组成之群。 20.根据申请专利范围第12项之方法,其中在步骤(b) 中藉着土壤杆菌调解之基因转移、直接DNA摄入或 植物病毒感染步骤,以转型该植物细胞和组织。 21.根据申请专利范围第12项之方法,更进一步包括 在步骤(c)之前,从步骤(b)之植物细胞或组织中,再 生基因转殖植物的步骤。 22.根据申请专利范围第12项之方法,其中以基因转 殖植物本身、植物的一部分、果实、叶片、茎、 块茎、种子或其萃取物之形式,提供该尘过敏原 。 图式简单说明: 图1:在衍生自矮南瓜黄化嵌纹病毒(ZYMV)之中国台湾品 系(TW-TN3)的病毒载体之病毒基因组的修改区中,核 酸和胺基酸序列的图解。显示ZYMV非密码区(粗 黑线)、密码区(空心盒子)和插入外来基因(粗线) 之基因组区域的相关部分之图解说明。以「/」表 示ZYMV之NIa蛋白加工处里的蛋白切开位置。为 了载体之建构,使用p35SZYMV2-26,其含有全长的cDNA至 TW-TN3的基因组ss(+)RNA,由花椰菜花叶病毒(CaMV)35S启 动基因驱动,在活体内产制传染性转录本。为了插 入外来基因,在HC-Pro密码序列的N-终端第2和第3个 胺基酸之间,创造Nco I位置。在p35SZYMVGFPhis中,将GFP 密码序列插入Nco I位置内,并在GFP之C终端插入NIa蛋 白切开位置(S-V-R-L-Q/S),产生自由形式的GFP。此 外,在GFP和NIa蛋白切开位置之间,设计数个限制 酵素位置和六组胺酸(His标签)。在p35SZYMVDerp5中,将 欧洲室尘5(Der p 5)蛋白质之欧洲室尘过敏原的 密码序列插入病毒载体内。在小括弧中显示由每 个构筑体产制之相对应的重组病毒。 图2:病毒-表现之vGFP和vDer p 5的西方墨点分析,以及 得自以ZYMV重组体感染之南瓜类植物的附加His标签 之蛋白质的金属亲和力纯化作用。A.)将得自等量( 0.01克)在感染后7天收集之叶片组织的萃取物装载 在凝胶(12.5%)上,并分离,然后移至硝基纤维素膜上 。分别使同时制备之墨点与抗GFP血清(A,跑道1-5)、 抗Der p 5血清(A,跑道6-8)或ZYMVV CP抗血清反应。在膜 的上方,显示用来接种的重组病毒(在图1中描述的) 。B.)得自分别以ZYMV-GFPhis(B,跑道2-4)和ZYMV-Derp5(B,跑 道6-8)感染之植物的附加His标签之vGFP和vDer p 5的亲 和力纯化作用。跑道1和5,FT代表得自被感染植物 之萃取物的Ni2+-NTA管柱的流通;跑道2至4,E1-3代表连 续250微升的Der p 5之洗脱溶离份,且M代表蛋白质标 记。vGFP/HC-Pro和vDer p 5/HC-Pro分别代表vGFP和vDer p 5 的融合形式。vGFP和vDer p 5各自/分别代表vDer p 5的 自由形式。CP代表ZYMV外壳蛋白。分别以1:4000、1: 4000和1:5000之稀释度,使用vGFP、vDer p 和ZYMV CP专一 的多株抗体。 图3:利用ELISA判定在以吸入vDer p 5(0.1%)攻毒Der p 5- 敏化之BALB/c老鼠的血清中,Der p 5专一之IgG(白色柱) 和IgE(黑色柱)的含量。以平均値SEM来表示数値。 在每个实验组中使用至少12只老鼠。星号(*)意指 与媒剂-处理的老鼠相比较,p<0.05。 图4:在以媒剂、低剂量vDer p 5(1毫克/公斤/天,持续 10天)、高剂量vDer p 5(10毫克/公斤/天,持续10天)处 理的Der p 5敏化之老鼠的支气管肺泡灌洗液中,嗜 曙红细胞、嗜中性白血球和单核细胞的数目。以 平均値SEM来表示数値。在每个实验组中使用12只 老鼠。星号(*)意指与媒剂处理的Der p 5攻毒之老鼠 相比较,p<0.05。 图5:利用ELISA判定在以吸入rDer p 5攻毒Der p 5敏化之 BALB/c老鼠的血清中,Der p 5专一之IgE的含量。*意指 与媒剂处理的老鼠相比较,p<0.1;**意指与媒剂处理 的老鼠相比较,p<0.05;***意指与媒剂处理的老鼠相 比较,p<0.001。 图6:利用ELISA判定在以吸入rDer p 5攻毒Der p 5敏化之 BALB/c老鼠的血清中,Der p 5专一之IgG的含量。*意指 与媒剂处理的老鼠相比较,p<0.1;**意指与媒剂处理 的老鼠相比较,p<0.05;***意指与媒剂处理的老鼠相 比较,p<0.001。 图7:在Der p 5敏化之老鼠的支气管肺泡灌洗液中,巨 噬细胞的数目。*意指与媒剂处理的老鼠相比较,p< 0.1;**意指与媒剂处理的老鼠相比较,p<0.05;***意指 与媒剂处理的老鼠相比较,p<0.001。 图8:在Der p 5敏化之老鼠的支气管肺泡灌洗液中,嗜 中性白血球的数目。*意指与媒剂处理的老鼠相比 较,p<0.1;**意指与媒剂处理的老鼠相比较,p<0.05;*** 意指与媒剂处理的老鼠相比较,p<0.001。 图9:在Der p 5敏化之老鼠的支气管肺泡灌洗液中,嗜 曙红细胞的数目。*意指与媒剂处理的老鼠相比较 ,p<0.1;**意指与媒剂处理的老鼠相比较,p<0.05;***意 指与媒剂处理的老鼠相比较,p<0.001。 图10:在过敏原敏化之BALB/c老鼠中,比较藉着供给 ZYMV-Der p 5与大肠杆菌-Der p5的Der p-5专一之IgE含量 。老鼠每天口服投与蒸馏水、ZYMV-Der p5和大肠杆 菌-Der p 5,持续21天,并在敏化作用后21,以0.1%Der p 5 攻毒。在18小时之后,收集血清,判定Der p-5专一之 IgE;1对于每组中的6只老鼠,以平均値SD来表示结果 。在ZYMV-Der p5或大肠杆菌-Der p 5与对照组之间,藉 着Mann-Whitney U检定,分别测试*p<0.1或**p<0.05。 图11:在过敏原敏化之BALB/c老鼠中,比较藉着供给 ZYMV-Der p 5或大肠杆菌-Der p5,在BALF中之IFN-量的提 高。老鼠每天口服投与蒸馏水、ZYMV-Der p5和大肠 杆菌-Der p 5,持续21天,并在敏化作用后21天,以0.1%Der p 5攻毒。在18小时之后,收集BALF,判定IFN-量;1对 于每组中的6只老鼠,以平均値SD来表示结果。在 ZYMV-Der p5或大肠杆菌-Der p 5与对照组之间,藉着Mann- Whitney U检定,分别测试*p<0.1。 |
