基因重组毕赤酵母生产番茄红素的方法

摘要

本发明是一种基因重组毕赤酵母生产番茄红素的方法。其特征在于从细菌Erwinia uredovora中克隆出合成番茄红素的三个关键基因CrtE、CrtB、CrtI，在巴斯德毕赤氏酵母中重建合成番茄红素代谢流，使巴斯德毕赤氏酵母产生番茄红素。斯德毕赤氏酵母菌(Pichia pastoris)FQR121，其保藏登记号为：CGMCC No.1257。本发明通过基因工程的手段，在巴斯德毕赤氏酵母中重建合成番茄红素代谢流，使巴斯德毕赤氏酵母产生番茄红素，采用基因工程巴斯德毕赤氏酵母能够大量生产番茄红素。

主权项

1、一种基因重组毕赤酵母生产番茄红素的方法，其特征在于，它是从细菌噬夏孢欧文氏菌(Erwiniauredovora)中克隆出合成番茄红素的三个关键基因CrtE、CrtB、CrtI，在巴斯德毕赤氏酵母中重建合成番茄代谢流，使巴斯德毕赤氏酵母产生番茄红素，具体步骤如下：(a)、工程菌的构建从细菌噬夏孢欧文氏菌中克隆出crtE、crtB、crtI基因，根据密码子兼并性进行优化，后进行基因的全合成：分别插入甘油三磷酸脱氢酶、磷酸甘油激酶基因、产朊假丝酵母中P14基因启动子和终止子之间，同时克隆巴斯德毕赤氏酵母rDNA基因片断作为载体整合的基因片段，再克隆卡拉霉素G418基因片断作为选择性标记；以PUC18为基础分别将上述基因片断连接在一起，构成新的载体pucEBI；载体pucEBI经SalI线性化用电击转化巴斯德毕赤氏酵母工程菌；采用卡拉霉素G418筛选转化子，出现红色的菌落经纯化后得巴斯德毕赤氏酵母工程菌，然后进一步进行PCR和核酸印渍杂交鉴定；(b)、转化子产番茄红素的提取和进一步鉴定转化子接种于由1％酵母抽提物、2％蛋白胨、2％葡萄糖、余量为水组成的培养基中，37℃、200转/分培养四天后，经5000转离心后，冻干，采用酵母裂解酶裂解，用带玻璃珠的丙酮抽提，再用石油醚抽提，抽提液再用真空干燥，干燥产物用甲醇和氯仿溶液溶解，溶解溶液用HPLC纯化，纯化样品即番茄红素用核磁共振进行鉴定。