检测马冠状病毒抗体的方法及专用试剂盒

摘要

本发明公开了一种检测马冠状病毒抗体的方法及专用试剂盒，包括包被有马冠状病毒核衣壳基因表达产物的聚苯乙烯酶标板的制备、反应板每空加入待检马血清反应、加入酶标记的抗马IgG单克隆抗体、显色、测定OD490nm值等步骤。本发明运用真核表达系统，重组杆状病毒感染昆虫细胞，大量扩增并获得马冠状病毒核衣壳基因表达的蛋白。所表达的蛋白抗原包被ELISA板，加入待检马血清、抗马IgG单克隆抗体、HRP酶标抗体，研制出了简单、方便安全、特异有效、灵敏廉价的方法和试剂盒，便于马冠状病毒的诊断和疫情监测及动物疾病的治疗，控制该病的流行和发生。

主权项

1、一种检测马冠状病毒抗体的方法，其特征是：包括下列步骤：(1)包被有马冠状病毒核衣壳基因表达产物的聚苯乙烯酶标板的制备：用22mM碳酸钠溶液包被真核系统表达的总蛋白，包被浓度10μg/ml，100μl/孔加入ELISA板孔中，4℃16小时，弃去包被液，用磷酸盐缓冲液洗涤，用吸水纸拍干，用5％脱脂奶粉液满孔封闭，并用磷酸盐缓冲液洗涤，干燥后得包被有马冠状病毒核衣壳基因表达产物的聚苯乙烯酶标板，即反应板；(2)反应板每空加入待检马血清，37℃反应45min，同时设空白对照B、阴性对照N、阳性对照P；其中待检马血清以1∶100比例用PBST稀释，阴性对照N是阴性马血清与PBST以1∶100比例稀释，阳性对照P是昆虫细胞总蛋白免疫的阳性小鼠血清与PBST以1∶200的比例稀释；弃去孔内液体，每孔加入磷酸盐缓冲液洗涤，用吸水纸拍干；(3)每孔加入酶标记的抗马IgG单克隆抗体，用磷酸盐缓冲液洗涤，吸水纸拍干；(4)每孔加入新鲜配制的0.4mg/ml的邻苯二胺底物应用液显色，37℃避光显色，显色结束后，每孔加入2M/L H2SO4 50μl/孔终止显色，测定OD490nm值。