重组人PEX原核表达质粒的构建和表达方法及其应用

摘要

重组人PEX原核表达质粒的构建和表达方法及其应用。根据人MMP2序列和克隆载体多克隆位点，设计PCR引物PEX462sense和PEX660Hindanti，利用PCR技术，扩增人MMP2 cDNA1676bp～2269bp片段，命名为PEX198/2，编码人MMP2从462aa到660aa的PEX片段。将PEX198/2片断重组于原核表达载体pET－His，构建表达人PEX的原核表达质粒pET－His/PEX。其人PEX N端含6个氨基酸的6×His标签序列和6个氨基酸的凝血酶识别酶切序列。将pET－His/PEX转化入大肠杆菌BL21(DE3)中，得到有活性的目的蛋白重组人PEX。

主权项

1.重组人PEX原核表达质粒的构建和表达方法，其特征在于包括以下步骤：步骤1：pGEX-4T-3/PEX215质粒的构建(1)以从胎盘提取的组织总RNA为模板逆转录合成PEX cDNA第一条链；(2)根据人MMP2序列(Genbank Accession No.：NM 004530)和载体pGEX-4T-3的多克隆位点，设计PCR引物PEX446S：序列为5’-CTG AAT TCC TCT CCT GAC ATT GAC CTT G-3’，上游引物，带限制性内切酶EcoR I酶切位点；PEX660A：序列为5’-CGC TCG AGA GGAAGG GCC TGT GG-3’，下游引物，带限制性内切酶Xho I酶切位点；(3)以逆转录合成的第一条链为模板，利用PCR技术，用上游引物PEX446S和下游引物PEX660A一起扩增人MMP2 cDNA 1629bp～2304bp片段，即长度为676bp的PEX cDNA片段，并重组入载体pGEX-4T-3中，得编码人MMP2从446aa到660aa的PEX片段PEX215；(4)将PEX215重组于GST融合蛋白表达载体pGEX-4T-3，获得序列正确的重组质粒pGEX-4T-3/PEX215；步骤2：PCR技术扩增人MMP2 C端片段PEX cDNA根据人MMP2序列(Genbank Accession No.：NM_004530)和载体pET-His多克隆位点，设计二条PCR引物PEX462sense和PEX660Hindanti，PEX462sense为上游引物，序列为5’-GAGAATTC CCTGTCACTCCTGAG-3’，带限制性内切酶EcoR I酶切位点；PEX660Hindanti为下游引物，序列为5’-GCGCAAGCTTAGCAGCCTAGCCAGTC-3’，带限制性内切酶Hind III酶切位点和终止密码子TAA；利用PCR技术，以pGEX-4T-3/PEX215质粒为模板，用上游引物PEX462sense和下游引物PEX660Hindanti一起扩增人MMP2 cDNA 1676bp～2269bp片段，即594bp的PEX cDNA片段PEX198/2，该cDNA片段编码人MMP2从462aa到660aa的PEX片段；步骤3：原核表达载体pET-His/PEX198/2的构建将原核表达载体pET-His和PCR反应扩增的PEX198/2片断经双酶切后，重组于原核表达载体pET-His，构建表达人PEX的原核表达质粒pET-His/PEX198/2；该质粒表达的人PEXN端含有6个氨基酸的6×His标签序列和6个氨基酸的凝血酶识别酶切序列，前者用于目的蛋白的纯化，后者可以被凝血酶识别并酶切以除去6×His标签；步骤4：载体pET-His/PEX198/2的原核表达及重组人PEX蛋白的纯化将人PEX的原核表达质粒pET-His/PEX198/2转化入大肠杆菌BL21(DE3)中，用异丙基b-D硫代半乳糖苷(IPTG)诱导，用尿素裂解缓冲液溶解包含体，用Ni-NTA agarose resin亲和纯化人PEX，复性后用水透析得到有活性的目的蛋白重组人PEX。