甘油通道蛋白基因缺失降低甘油生成提高乙醇产量的酿酒酵母菌株及构建方法

摘要

本发明公开了一种甘油通道蛋白基因缺失降低甘油生成提高乙醇产量的酿酒酵母菌株及构建方法，构建方法包括如下步骤：(1)酿酒酵母单倍体的获得及URA3基因的缺失；(2)PUC18-FPS1-ORF质粒的构建；(3)PUC18-FUF质粒的构建；(4)KAM-21菌株的构建，本发明采用基因工程技术缺失编码镶嵌在细胞膜上的甘油通道蛋白FPS1基因，丧失FPS1基因的表达，由于细胞膜上没有甘油通道蛋白Fps1p，细胞内产生的甘油无法分泌到细胞外而在细胞内积累，甘油合成途径受到细胞内积累的甘油反馈抑制，甘油代谢向乙醇代谢转换，增加了乙醇产量，解决了乙醇生产成本高、发酵周期长、对环境污染严重等系列问题。

主权项

1.一种甘油通道蛋白基因缺失降低甘油生成提高乙醇产量的酿酒酵母菌株的构建方法，其特征包括如下步骤：(1)酿酒酵母单倍体的获得及URA3基因的缺失酿酒酵母子囊孢子的形成：取适量新活化的双倍体酿酒酵母(S.cerevisiae)细胞均匀地涂在醋酸钾产子囊孢子培养基上，26℃～30℃培养2～3天，在所述培养基酵母涂层上刮取适量的酵母细胞，溶解到装有50μl无菌水的1.5ml离心管中，加入浓度为10～20mg/ml的蜗牛酶3～10μl，37℃消化子囊壁10～30min；酿酒酵母子囊孢子的拆分：向上述离心管中缓缓加入1ml无菌水，倒置1～4min，取30～50μl液体，滴到YPD平板边缘上，倾斜平板使细胞液在平板边缘形成条形状，干燥后在显微操作仪上进行子囊孢子拆分，直接将玻璃针尖上的子囊孢子摆放到YPD培养平板上，30℃的条件下培养2～3天，将单个子囊孢子长出的菌落转接到YPD液体试管中培养，培养7-8小时，收集菌体进行染色体提取、电泳进行单倍体验证，电泳图上仅出现一条544bp或404bp电泳带，证明是单倍体，再经过发酵挑选优良的出发酵母菌株KAM-19；KAM-19菌株URA3基因的缺失：对质粒PJJ242中编码URA3基因的DNA片段用Nco I单酶消化，用Klenow大片段补平，再用T4连接酶进行平末端连接，得到含有失活URA3片段的PJJ242质粒；用HindIII限制性内切酶把所述失活的URA3基因切下，采用醋酸锂方法将所述失活的URA3基因转化到酵母细胞KAM-19中进行基因重组，使KAM-19染色体上的URA3基因由质粒PJJ242上失活的URA3基因取代，将转化的酵母细胞涂在5-氟乳清酸平板上，凡是在该平板上生长出的酵母菌株为URA3缺陷型菌株-KAM-20；(2)PUC18-FPS1-ORF质粒的构建酵母染色体的制备：将双倍体酿酒酵母菌接种到含有5mlYPD培养液的试管中，30℃条件下振荡培养8-10小时，然后将培养液倒入1.5ml离心管中，12000rpm离心30sec后，弃掉上清液，沉淀用0.5ml无菌水重悬，然后12000rpm离心30sec，收集菌体；往装有菌体离心管中加入200μl破菌缓冲液重悬细胞，同时加入200μl体积玻璃珠和200μl pH＞7的苯酚或氯仿，振荡3～4min；加200μlTE缓冲液振荡，12000rpm离心5min，室温下将水相转移到一个干净的离心管中，加1ml无水乙醇，颠倒混匀；室温下12000rpm离心3min，弃掉上清液，沉淀用0.4mlTE缓冲液重悬；加3μl的1mg/mlRNA分解酶，混和均匀，37℃条件下温育5min；加10μl3mol/L乙酸铵、1ml无水乙醇，颠倒混匀，室温下高速离心3min，弃上清液，干燥沉淀，用100μlTE缓冲液重悬，得到酵母染色体；扩增FPS1-ORF基因：根据酿酒酵母染色体上FPS1基因序列设计引物，FPS1-上引为：5’-CCCGGGGAATTCTAGTAGGAGAGCAGAGTGTC-3’，FPS1-下引为：5’-TATAGTAGGTGACCAGGCTG-3’；PCR反应体系为：上、下引物均为1μl；200μM的d NTP4μl；缓冲液5μl；所述酵母染色体为模板0.5μl；双蒸水38.25μl；聚合酶0.25μl，PCR反应条件为：94℃预变性4min；94℃变性30sec；58℃退火30sec；72℃延伸1min；得到PCR扩增产物FPS1-ORF基因；PUC18和FPS1-ORF基因的消化：将扩增的FPS1-ORF产物4μl和载体PUC18 4-μl分别用EcoR I和HindIII各为0.25～0.5μl，10×酶缓冲液2μl；用无菌水将总体积补加到20μl，在37℃条件下消化1～2小时；试剂盒纯化回收DNA片段：将扩增的FPS1-ORF和载体PUC18的双酶切产物分别从琼脂糖凝胶上切下，加2-5倍体积溶胶液，46～50℃水浴放置5～15min，300rpm振荡，使琼脂糖凝胶完全溶解，加到一个吸附柱中，13000rpm离心5min，倒掉收集管中的废液；加入700μl漂洗液中，13000rpm离心5min后弃废液，然后重复一次；取出吸附柱，放到离心管中，加入洗脱缓冲液22μl，.室温放置1min，13000rpm离心3min；PUC18片段和FPS1-ORF基因片段的连接：在20μl连接体系中，加入2μl 10×T4连接酶缓冲液，1μl T4连接酶，FPS1-ORF基因片段和载体PUC18片段的加入量分别为5-7μl和6-8μl，加水至20μl体系，在16℃条件下连接2～3h，通过酶切验证得到PUC18-FPS1-ORF质粒；(3)PUC18-FUF质粒的构建通过引物对PUC18-FPS1-ORF质粒进行PCR扩增，引物PUC18-F-上引为：5’-ATTTTTCTGCAGTGAGAAAACAGACAAGAAAAAGA-3’；引物PUC18-F-下引为：5’-AGGCTGTCAAGATGCATTAGAATGTACCCTCG-3’，以质粒PUC18-FPS1 ORF为模板进行PCR扩增，得到的PCR产物为PUC18-FF，其两端各带有FPS1的450bp和120bp碱基，以YEPLac195质粒上的URA3基因为模板，引物URA3-上引为：5’-GTC GAC TCT AGA GTA GTC TAG TAC CTCCTG TG-3’；引物URA3-下引为：5’-GTC GAC CTG CAG GAA AAG TGC CAC CTG ACG TC-3’，引物进行PCR扩增，得到的PCR产物为URA3-ORF，两套引物上都分别含有PST I和BamHI酶切位点；所述两套PCR产物分别用PST I和Xba I双酶消化，T4连接酶连接，然后转化到提前制备成感受态的大肠杆菌Top10中，提质粒进行酶切电泳验证，得到PUC18-FUF质粒；(4)KAM-21菌株的构建对PUC18-FUF质粒进行双酶消化：将PUC18-FUF质粒用ECoR I和HindIII进行双酶消化得到两端分别带有FPS1同源片段和URA3标记基因，总长度为1.93kb DNA片段；1.93kb DNA片段转化到酵母细胞内与转化子的筛选：将待转化的URA3缺陷型酵母菌株KAM-20转接到装有5ml YPD培养液的试管中，30℃200rpm 8-10小时培养，13000rpm30s离心收集菌体，用1ml无菌水清洗细胞；将一管SS-担体DNA沸水煮沸3-7min，放到冰上保持1-3min；往离心管中加入转化混合物，所述转化混合物为：重量体积百分比为50％的3500 PEG 240μl；1.0M醋酸锂36μl；浓度为2mg/ml的SS-担体DNA50μl；1.93kb DNA片段34μl；振荡混匀，置于预热的42℃水浴中30min；13000rpm离心30s收集菌体；用100μl无菌水重悬菌体，涂布于省却特定氨基酸成分的CM平板上，26-32℃培养，将2～3天后培养基上长出的菌落进行染色体提取通过PCR的方法进行验证，电泳后片段大小为1.93kb的转化子为正确的，即得到了一种甘油通道蛋白基因缺失降低甘油生成提高乙醇产量的酿酒酵母菌株-KAM-21。