玉米胚乳ADP－葡萄糖焦磷酸化酶突变体及其筛选方法与应用

摘要

本发明公开了一种玉米胚乳ADP－葡萄糖焦磷酸化酶突变体及其筛选方法与应用。该筛选方法包括以下步骤：1)用盐酸羟胺突变剂对玉米胚乳AGPase大小亚基cDNA在70－80℃温浴条件下进行随机突变；2)将经突变的玉米胚乳AGPase大小亚基cDNA和作为对照的野生型玉米胚乳AGPase大小亚基cDNA分别转化大肠杆菌glgC突变菌株，筛选阳性单克隆；3)将阳性克隆划线接种于Conberg加富固体培养平板上，在35－39℃下培养；4)用碘－碘化钾溶液对在Conberg加富固体培养平板上长出的单菌落进行染色，与对照菌落的颜色进行比较，比对照颜色深的为突变体菌株，再经测序验证，得到玉米胚乳ADP－葡萄糖焦磷酸化酶突变体。本发明的玉米胚乳ADP－葡萄糖焦磷酸化酶突变体及其筛选方法将在玉米的品种改良中发挥重要作用。

主权项

1、一种筛选玉米胚乳ADP-葡萄糖焦磷酸化酶突变体的方法，包括以下步骤：1)用盐酸羟胺突变剂对玉米胚乳AGPase大小亚基cDNA在70-80℃温浴条件下进行随机突变；所述盐酸羟胺突变剂配方为：0.15-0.25g盐酸羟胺，125mM pH7.0的焦磷酸钠1.0-1.6mL，1M的NaCl 0.2-0.4mL，500mM pH8.0的EDTA 10-14μl，用无离子水定容至3mL；2)将步骤1)中经突变的玉米胚乳AGPase大小亚基cDNA和作为对照的野生型玉米胚乳AGPase大小亚基cDNA分别转化大肠杆菌glgC突变菌株，筛选分别转化有经突变的玉米胚乳AGPase大小亚基cDNA和野生型玉米胚乳AGPase大小亚基cDNA的阳性单克隆；3)将步骤2)筛选的阳性克隆接种于Conberg加富固体培养平板上，在35-39℃下培养12-24小时；所述Conberg加富固体培养基配方为：磷酸二氢钾8-9g，磷酸氢二钾10-12g，酵母提取物5-7g，葡萄糖8-12g，琼脂15-25g，用水定容至1L，最终pH 7.0；4)用碘-碘化钾溶液对在步骤3)中Conberg加富固体培养平板上长出的单菌落进行染色，与对照菌落的颜色进行比较，比对照颜色深的为突变体菌株，再经测序验证，得到玉米胚乳ADP-葡萄糖焦磷酸化酶突变体；所述碘-碘化钾溶液是含0.08-0.12mol/L碘和0.25-0.35mol/L碘化钾的水溶液。