| 摘要 |
Procedimiento para la preparación de un constructo de expresión circular, cerrado en forma de anillo, a partir de una doble cadena de ADN, que se compone de los siguientes pasos: a) Corte de una secuencia de ADN bicatenario de un plásmido amplificable en células procarióticas o eucarióticas mediante una digestión primaria con endonucleasas de restricción, b) en la que los sitios de corte limitan directamente por ambos lados y sin bases intercaladas las secuencias de un casete de expresión compuesto por i. al menos una secuencia promotora, ii. al menos una secuencia codificante y iii. al menos una secuencia de poliadenilación, y c) ligación intramolecular siguiente de los fragmentos de restricción generados de manera que la reacción de ligación proporcione una doble cadena de ADN cerrada covalentemente (cierre de anillo), seguida de d) una digestión secundaria de la mezcla de reacción con una endonucleasa de restricción que reconoce y corta una secuencia de reconocimiento que no está presente en el constructo de expresión que se ha de preparar pero que sí aparece al menos una vez en el resto del plásmido biológicamente amplificable, y e) degradación simultánea o posterior del resto de cadena abierta del plásmido biológicamente multiplicable con una exonucleasa específica para los extremos 3'''' y 5'''' del ADN y f) purificación del casete de expresión cerrado en forma de anillo de una doble cadena de ADN.
|
