METODO DE HIDRATACION SUSTRACTIVA.

摘要

Un método para realizar una hibridación sustractiva utilizando una muestra de verificador y una muestra de director para determinar la presencia de una diferencia en la secuencia de un ácido nucleico entre la muestra de verificador y la muestra de director que comprende: (a) aislar por separado el ácido nucleico total de la muestra de verificador y la muestra de director, y generar ADNc/ADN de doble hebra a partir de dicho ácido nucleico total de dicha muestra de verificador y dicha muestra de director; (b) digerir dicho ADNc/ADN de doble hebra generado a partir de la muestra de verificador y dicha muestra de director de la etapa (a) con una endonucleasa de restricción con el fin de producir un grupo de fragmentos de restricción para cada muestra; (c) ligar dichos fragmentos de restricción del director y del verificador de cada grupo de la etapa (b) a un grupo de adaptadores oligonucleotídicos 1, y amplificar los productos resultantes con cebadores selectivos de manera que un subgrupo de dichos fragmentos de restricción de la etapa (b) sea amplificado; (d) separar dichas secuencias cebadoras selectivas (primera ronda) o secuencias adaptadoras (rondas siguientes) mediante digestión con endonucleasa de restricción con el fin de producir amplicones de verificador y director, ligar los extremos 5'' de dichos amplicones de director y verificador a un grupo de adaptadores oligonucleotídicos 2 para formar un control director y un verificador, mezclar el control director y el verificador por separado con un exceso de amplicón de director no ligado cada uno, desnaturalizar dichas mezclas resultantes, y permitir que las hebras de ácido nucleico desnaturalizado de cada mezcla hibriden; (e) rellenar los extremos 3'' del director/verificador rehibridado y del control director/director rehibridado utilizando una ADN polimerasa termoestable y amplificar las secuencias resultantes; (f) separar el ADN de hebra sencilla restante mediante digestión con una ADN nucleasa de hebra sencilla y amplificar; etapas (d) a (f), donde las etapas (d) a (f) utilizan un grupo de adaptadores oligonucleotídicos no utilizado en ninguna ronda de RDA previa, donde una ronda consta del funcionamiento de las etapas (d) a (f), y utilizan como director, para cada nueva ronda de RDA, el producto escindido con la endonucleasa de restricción de la sustracción de control director/director de las etapas inmediatamente precedentes (d) a (f).