分枝杆菌分子菌种鉴定试剂盒的制备及其应用

摘要

本发明涉及一种分枝杆菌分子菌种鉴定试剂盒及其制备方法，可以根据不同种分枝杆菌16S rRNA基因序列，设计、合成相应的寡核苷酸探针，通过点样法将寡核苷酸探针按一定的顺序点在经预处理的硝酸纤维膜上，制成检测鉴定膜片，与带生物素标记的PCR扩增产物杂交。利用本发明的鉴定试剂盒，根据探针杂交的蓝紫色信号强弱用肉眼判读结果，可同时快速、准确地检测分枝杆菌，鉴别分枝杆菌与非分枝杆菌及结核分枝杆菌复合群与非结核分枝杆菌，鉴定分枝杆菌菌种，24小时内即可报告结果，从而辅助临床诊断、指导临床开展早期有效的化疗。

主权项

1、一种分枝杆菌分子菌种鉴定试剂盒，含有分枝杆菌分子菌种鉴定膜片和 分枝杆菌PCR扩增试剂，其特征在于：所述分枝杆菌分子菌种鉴定膜片是在硝 酸纤维膜上固定一系列针对分枝杆菌属和各种分枝杆菌16S核糖体核糖核酸而设 计的寡聚核苷酸探针，所述的寡聚核苷酸探针在3’末端加有50-110个脱氧核糖核 酸；所述的分枝杆菌PCR扩增试剂包括针对分枝杆菌属16SrRNA进行扩增所需 的5-10倍PCR缓冲液，浓度各为2.5mmol/L的dGTP、dCTP、dATP和dTTP， 浓度各为2.5-12.5μmol/L的5’端带生物素标记的上游引物和不带标记的下游引物 以及1-10U/μlTaqDNA聚合酶；所述的寡聚核苷酸探针序列如下表所示： 探针名称 探针序列 M 5’-TATTAGACCCAGTTTCCC-3’ a 5’-ACAAGACATGCATCCCGT-3’ b 5’-GACATGCGTCTTGAGGTC-3’ c 5’-TAAAGACATGCGCCTAAA-3’ d 5’-CGCCAAGTGGTCCTATCC-3’ h 5’-CACACCATGCAGCATG-3’ i 5’-CAGAACATGCATCCCA-3’ j 5’-CGCAGAATGGTCCTATCC-3’ k 5’-CATGTGTCCTGTGGTCCT-3’ l 5’-CATGCGCCTCGGGGTCCT-3’ m 5’-AGGACATGAATCCCGT-3’ n 5’-ATGCGACCAATAGGGAAT-3’ o 5’-CACACCAGGAAGTGCG-3’ p 5’-ACTCACCATGAAGTGTGT-3’ q 5’-CGACCAGCAGGGTGTATT-3’ r 5’-ACACACCATGAAGCGCGT-3’ s 5’-TCCCAGCCATGCAACCAG-3’ t 5’-CACACACCATGAAGCAT-3’ u 5’-GACATGCATCGCGTAG-3’ w 5’-CACCATGCGACATGTG-3’ y 5’-AGACAATGCAGCCAGA-3’ z 5’-CACCCCATGAAGAGCG-3’ aa 5’-CCACCAGGCCATGCGA-3’ ab 5’-CACATGCATGCCGTGG-3’ ac 5’-CAACCCATGAAGGCCA-3’ 所述的5’端带生物素标记的上游引物和不带标记的下游引物序列如下表所 示。 靶基因 引物序列(5’→3’) 16S rRNA 上游引物5′-bio-CGAGTGGCGAACGGG TGAGG--3′ 下游引物5′-TTGTGCAATATTCCCCAC TGCTG--3′