重组表达的羧肽酶B及其纯化

摘要

本发明提供了一种生产来源于非动物宿主有机体的，具有来自前羧肽酶B酶原的羧肽酶B活性的蛋白的制备方法。在非变性条件下，由酶原活化得到羧肽酶B。尤其是，该活化是在避免前肽与活化的羧肽酶B酶的不必要的非共价结合的条件下进行的。

主权项

1.一种生产具有羧肽酶B活性的蛋白的方法，包括如下步骤：a)提供一种含有编码由N-末端与组氨酸标记融合的大鼠前羧肽酶B和信号肽构成的前体蛋白的核苷酸序列的载体，由此在组氨酸标记和信号肽之间或在组氨酸标记和大鼠羧肽酶B之间任选地插入一种间隔序列；(b)采用该载体转化一种微生物宿主有机体；(c)在含有营养物和碳源的生长培养基中培养该微生物宿主有机体，其中微生物宿主有机体表达前体蛋白并将组氨酸标记的前羧肽酶B分泌至生长培养基中；(d)把步骤(c)的生长培养基中的分泌的组氨酸标记的前羧肽酶B固定在能结合组氨酸标记的颗粒状的金属螯合物亲和基质上，并冲洗颗粒状的金属螯合物亲和基质，从而将组氨酸标记的前羧肽酶B固定；(e)在一种含有胰蛋白酶的缓冲液中温育步骤(d)中的带有固定化的组氨酸标记的前羧肽酶B的颗粒状的金属螯合物亲和基质，由此通过蛋白水解方式酶切前羧肽酶B部分并将具有羧肽酶B活性的蛋白释放到液相中，由此组氨酸标记的前肽部分被固定；(f)从颗粒状的金属螯合物基质中分离含有具有羧肽酶B活性的蛋白的液相，由此组氨酸标记的前肽部分被固定；和(g)从步骤(f)的液相中纯化具有羧肽酶B活性的蛋白。