筛选中药抗血小板聚集作用活性成分的细胞膜固相色谱法模型的建立方法

摘要

本发明提供了一种筛选中药抗血小板聚集作用活性成分的细胞膜固相色谱法模型的建立方法，该方法包括如下步骤：待筛选中药姜油树脂供试液指纹图谱的建立；鸡血小板悬液的分离；血小板细胞膜固相化待筛选中药姜油树脂供试液中的效应成分；未结合成分的洗脱；血小板固相化姜油树脂中活性成分的解离；血小板固相化活性成分解离液的HPLC色谱分析。本发明用鸡血小板固相色谱技术作为抗血栓药物初筛的细胞模型，来源丰富、成本低，可以对具有抗血小板聚集作用的中药进行活性成分筛选，具有良好的应用前景。

主权项

1、一种筛选中药抗血小板聚集作用活性成分的细胞膜固相色谱法模型的建立方法，其特征在于包括如下步骤：(1)待筛选中药姜油树脂供试液指纹图谱的建立：精密称取5mg姜油树脂，以2％吐温-80溶解，得姜油树脂供试液，经水相滤膜滤过，滤液供HPLC分析，确定姜油树脂供试液中的共有指纹峰；(2)鸡血小板悬液的分离：将鸡全血收集在含枸椽酸三钠的抗凝剂的塑料离心管中，再将抗凝血分装至塑料离心管中，在22℃以680转/分离心10min，吸取上层富血小板血浆，再将富血小板血浆以2800转/分离心10min，使血小板沉淀，将血小板用pH 7.4PBS洗涤后，调成1010个/ml血小板悬液；(3)血小板细胞膜固相化待筛选中药姜油树脂供试液中的效应成分：取血小板悬液5ml加入1ml步骤(1)中配制的姜油树脂供试液，混匀后置于37℃水浴中振荡结合，使姜油树脂中活性成分充分与血小板膜受体结合；(4)非特异性结合成分的洗脱：以2倍量22℃的pH7.4的PBS洗涤步骤(3)中的固相化效应成分后的血小板悬液，使成均匀悬液，2800转/分离心10min，弃上清液，取下层血小板洗涤，使非特异性结合成分洗脱；(5)血小板固相化姜油树脂中活性成分的解离：向经步骤(4)洗涤后的结合有药物效应成分的血小板悬液中加入3ml pH 4的PBS溶液，使成均匀悬液，置于37℃水浴中振荡30min后，2800转/分离心10min，上清液为活性成分解离液；(6)血小板固相化活性成分解离液的HPLC色谱分析：将活性成分解离液通过固相萃取柱，保留液过有机滤膜，氮气挥发浓缩至200μl，HPLC分析，通过比较活性成分解离液和姜油树脂指纹图谱中各吸收峰的比例，确定与血小板特异结合的特征峰，得到活性成分的特征峰。