HIV－1gp120与人γ干扰素融合蛋白的制备方法

摘要

本发明公开了HIV－1gp120与人γ干扰素融合蛋白的制备方法。通过构建HIV－1gp120N端的三分之一片段与IFN－γ(gp120N/IFN－γ)融合基因的原核表达质粒pet44b－gp120N/IFN－γ，并将该质粒在大肠杆菌(DE3)细胞中进行低温诱导表达和鉴定，本发明成功构建了pet44b－gp120N/IFN－γDNA重组体并成功在原核细胞中进行了蛋白表达。通过在体刺激Balb/c小鼠，检测融合蛋白与单纯gp120蛋白在诱导小鼠免疫反应特别是细胞免疫反应的差异，证明了IFN－γ在gp120N/IFN－γ融合蛋白中发挥了免疫佐剂的作用，增强了特异性抗体的产生，更为显著的是，增强了特异性细胞免疫反应包括CTL作用和Th1型细胞因子分泌水平。

主权项

1、HIV-1gp120与人γ干扰素融合蛋白的制备方法，其特征在于下述步骤：(1)根据pEGFP-N1/gp120质粒图谱，设计gp120/pEGFP-N1的一对引物，在5’端和3’端分别引入Ecor I和Hind III识别位点：A/ATTCT和A/AGCTT，用PCR法高保真扩增gp120N端566bp片段，并纯化PCR产物，备用；(2)参考Genebank E00692设计IFN-γ的一对引物，用LA Tag DNA po1ymerase，以IFN-γ质粒为模板进行聚合酶链反应(PCR)，PCR产物回收、纯化后用T-A克隆的方法插入TOPOT-A克隆载体，连接产物转化TOP 10F感受态细胞，抽提TOPO-IFN-γ重组质粒DNA，作ECOR I单酶切鉴定，得到IFN-γ片段；(3)对gp120片段、IFN-γ片段及它们的表达载体Pet44b进行酶切，gp120片段与表达载体Pet44b、IFN-γ片段与表达载体Pet44b分别连接，连接产物转化TOP 10F感受态细胞，挑单个白色菌落扩增，抽提gp120/pet44b和IFN-γ重组质粒DNA，分别作双酶切鉴定，用gp120酶切位点酶切IFN-γ+pet44b质粒，产物与gp120片断连接，得到pet44b-gp120N/IFN-γ表达载体，连接产物转化TOP 10F感受态细胞，挑单个菌落扩增，抽提pet44b-gp120N/IFN-γ重组质粒DNA，并鉴定所得重组质粒；(4)制备BL21(DE3)感受态细胞，取连接产物加入感受态细菌中，转化成功后复苏培养细菌，取菌液，在含氨苄青霉素的LB平板上培养，挑选单个菌落，摇菌、抽提质粒；(5)以PCR法对pet44b-gp120以及pet44b-gp120/IFN-γ重组质粒转化入DE3细胞进行验证；(6)IPTG低温诱导gp120蛋白和gp120/IFN-γ融合蛋白在原核细胞株DE3的表达；(7)冷冻、浓缩并纯化细胞培养上清液，得到均质gp120和gp120/hIFN-γ融合蛋白。