质粒DNA大规模纯化工艺

摘要

本发明涉及一种质粒DNA的纯化工艺，为包括使用3M醋酸钾、十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)和TritonX-114来纯化质粒DNA，能够很好地去除宿主RNA、宿主杂蛋白、宿主内毒素和宿主的基因组DNA，所纯化的质粒DNAOD₂₆₀/OD₂₈₀能达到1.75-1.85，制备成本低。

主权项

1.一种质粒DNA的纯化方法，该方法包括下列步骤：第一步：基因工程重组菌的发酵：从种子库中取出一支含重组质粒的大肠杆菌，在抗性平板上划线长成单菌落后，于含有相应抗生素的液体培养基中进行扩大培养，并以10％的比例接种到10L发酵罐中，以30％溶解氧，pH为7.0的条件下发酵含有重组质粒的大肠杆菌，在发酵过程中，以OD600来监测重组菌的生长状态，当细菌达到对数生长期后期时停止发酵，离心收集重组菌菌体；第二步：按照每克湿菌加入5ml溶液I的量加入溶液I将重组菌体进行悬浮，然后按照1∶2∶1.5的比例加入溶液II和溶液III进行变性和复性，以6000g离心10分钟并收集上清，取一小份加入0.7倍体积的异丙醇或者两倍体积无水乙醇沉淀质粒DNA，沉淀的质粒DNA用TE溶解后，以1％琼脂糖凝胶电泳结合λHind III Marker，用凝胶分析软件分析定量，并计算出所收集上清中含有的质粒DNA总量；第三步：根据质粒DNA总量，加入5％十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)，以200转/分钟的转速搅拌均匀后，于20℃以8000g离心15min收集沉淀，弃上清，沉淀用3M醋酸钾溶液溶解后，在4℃以10000g离心15min，弃沉淀，保留上清；第四步：在上清中加入0.7倍体积的异丙醇或者2倍体积的无水乙醇，在4℃以10000g离心15min，保留沉淀，弃上清，最后将质粒DNA用75％酒精洗涤两次，并溶解在不含内毒素的双蒸水中；第五步：在质粒溶解液中加入TritonX-114，剧烈振荡后置于冰上孵育10分钟，然后将含有TritonX-114的溶液加热到50℃，10分钟后以10000g离心10分钟，所获得的上清即为已纯化的质粒DNA溶液；其中所述溶液I、溶液II和溶液III的组成为：溶液I：25mM/L Tris-Cl，10mM/L EDTA，50mM/L葡萄糖；溶液II：0.2M NaOH，1％SDS；溶液III：5mM/L乙酸钾，冰乙酸11.5ml，H2O 28.5ml。