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1、一种人外泌汗腺上皮细胞培养方法，其特征在于：1)它由人外泌汗腺挑取、酶消化、离心纯化、培养基配制、二维培养、传代培养和三维构建汗腺样管状结构培养七步过程组成；2)人外泌汗腺挑取是首先获取健康人的皮肤切除术后皮条，并立即置于D-Hank’s液中反复冲洗3-5次，再用眼科剪剪碎后置于磷酸盐缓冲液中重悬，然后将组织悬液置于至少20倍解剖显微镜下观察，用眼科镊直接挑取人外泌汗腺；3)酶消化是将挑取的人外泌汗腺置入体积分数为0.01-0.8％的IV型胶原酶中，在37℃消化4-18小时，并不时摇动，使组织消化均匀、完全；4)离心纯化是将D-Hank’s液40-50ml加入到酶消化好的人外泌汗腺组织中，反复离心3-5次，每次2000-3000rpm×5min，获得纯化的人外泌汗腺上皮细胞，用0.2％台盼兰计数活细胞数；5)培养基配制是在无血清表皮细胞培养基中加入5ug/L的表皮生长因子和50mg/L的牛垂体提取物，获得汗腺上皮细胞的培养基，保存备用；6)二维培养是将纯化的人外泌汗腺上皮细胞用汗腺上皮细胞的培养基重悬，制得人外泌汗腺上皮细胞重悬液，再加入到涂有胶原的培养瓶中接种，接种密度为1-100×103个细胞/cm2，盖紧胶塞，置于37℃，5％CO2 的孵箱培养，每3天更换汗腺上皮细胞的培养基一次，每天取样置于显微镜下观察细胞生长情况，至细胞融合度达70％～80％；7)传代培养是将融合度达70％～80％的细胞每瓶加胰酶0.5ml，在37℃孵箱中消化5～10min，当细胞变圆、细胞间隙增大时，用胰酶抑制剂终止消化，加入D-Hank’s液10ml，离心2000-3000rpm×5min，获得的细胞再加入汗腺上皮细胞的培养基重悬，接种于瓶底涂有胶原的培养瓶中，接种密度为1-20×104个/cm2，置于37℃，5％CO2孵箱中继续扩增培养，每3天更换汗腺上皮细胞的培养基一次，每天取样置于显微镜下观察细胞生长情况；8)三维构建汗腺管状结构培养是在冰浴条件下，将纯化的人外泌汗腺上皮细胞以1-50×103个/ml的密度，混合于Matrigel凝胶中，以每孔2ml加入到12孔板中，再加入汗腺上皮细胞的培养基2ml/孔进行三维培养，并每3天更换汗腺上皮细胞的培养基一次，每天取样置于显微镜下观察细胞生长情况，培养生长9天后的细胞团取样固定、切片、HE染色观察管状结构形成情况。 |
