壳聚糖内切酶的制备方法

摘要

本发明公开了一种壳聚糖内切酶的制备方法。用高产壳聚糖酶菌株(国家发明专利号ZL 02159880.0，菌种保藏号为CGMCC No.0851)，接种到加入适量壳聚糖、氮源和无机盐的溶液的发酵罐中培养，过滤除去大部分悬浮菌体，得到壳聚糖酶粗酶液，发酵粗酶液，先后采用超滤浓缩、有机溶剂或硫酸铵沉淀、阳离子交换和凝胶过滤、冷冻真空干燥等分离纯化的方法分离纯化得到一种壳聚糖内切酶。本发明的菌种遗传性稳定，发酵条件常规化，得到的壳聚糖内切酶纯度较高，适用于制备相对分子质量分布较窄的高纯度壳低聚糖产品。

主权项

1、一种壳聚糖内切酶的制备方法，其特征在于方法的步骤如下：1)将保藏号为：CGMCC No.0851的高产壳聚糖酶生产菌Penicillium sp接种在5L的发酵罐中，培养基装液量3-4L，接种量为10％-20％，培养温度为26-32℃、搅拌速度为200-450r·min-1、通气量为1.5-5L·min-1，发酵50-80小时后，过滤除去悬浮菌体得到壳聚糖粗酶液，所述的培养基为：壳聚糖5-40g/L、尿素0.5-3g/L、磷酸二氢钾0.2-1g/L、硫酸铵0.5-3g/L、硫酸镁0.1-0.5g/L；2)截留相对分子质量为2-20kDa的超滤膜对粗酶液进行超滤，然后，用2-4倍的冰乙醇沉淀或者用20％-80％硫酸铵分级沉淀得到壳聚糖粗酶沉淀物；3)用pH 4.4-5.5，10-50mmol乙酸缓冲液溶解壳聚糖粗酶沉淀物，再上HiPrep 16/10SP XL阳离子交换柱，用含0.5-2mol氯化钠、10-50mmol乙酸缓冲液，0-100％线形梯度洗脱，得到壳聚糖内切酶溶液；4)用Sephadex G 50凝胶过滤柱过滤，乙酸缓冲液洗脱，浓缩、冷冻、真空干燥得到壳聚糖内切酶。