利用农副产品固体发酵低成本生产γ－聚谷氨酸的方法

摘要

本发明公开了一种利用农副产品固体发酵低成本生产γ－聚谷氨酸的方法，其包含以下步骤：1.菌种保藏；2.种子液的制备；3.使用摇瓶固体发酵法发酵种子液；4.γ－PGA的提取和纯化。本发明提供的利用农副产品固体发酵低成本生产γ－聚谷氨酸的方法，可使γ－PGA的产量达到100g/kg培养基以上，纯化后的γ－PGA纯度达到95％以上，对于不同纯度的γ－PGA的生产成本在1.5万－3万/吨之间，大大低于采用现有技术的生产成本。

主权项

1.一种利用农副产品固体发酵低成本生产γ-聚谷氨酸的方法，其包含以下步 骤： 1.菌种的保藏：将能产生γ-PGA的微生物的菌种在固体培养基斜面上于 25-38℃培养，可于2-8℃短期保藏， 固体培养基的成分包含：蛋白胨0.5-1.0％，酵母粉0.1-1％，NaCl0.1-5％， 琼脂1-2％，PH为5.5-8.5； 2.种子液的制备： 2.1.将上述种子转入含液体培养基的瓶中，在25-38℃，150-250rpm培 养3-10小时至对数生长中期；液体培养基的成分是蛋白胨0.5-1.0％，酵母粉 0.1-1％，NaCl0.1-5％，琼脂1-2％，PH为5.5-8.5； 2.2.按照每升培养基的加入量配制种子培养基：葡萄糖10-60克；蛋白 胨0.5-20克；谷氨酸5-80克；柠檬酸4-30克，氯化铵2-30克；K₂HPO₄0.1-4 克；MgSO₄·7H₂O0.1-4克；FeCl₃·6H₂O0.01-1克；CaCl·2H₂O0.05-4克； MnSO₄·H₂O0.05-1克；补充蒸馏水至1000ml，灭菌前PH为5.5-8.0；250ml 的摇瓶中分装50ml的培养基；并按0.1-10％的接种量将上述活化好的菌种转 入，25-38℃下培养3-10小时至对数中期； 3.摇瓶固体发酵： 3.1.发酵培养基：固体发酵培养基分包含固体成分和营养液两部分，固 体成分为黄豆饼粉和麸皮，它们的质量比为0.6-2.5；营养液成分为(g/L)： 甘油5-80，柠檬酸7-40，谷氨酸5-80，氯化铵2-30，MgSO₄·7H₂O0.1-1.0， FeCl₃·6H₂O0.01-1，CaCl₂·2H₂O0.05-0.2，MnSO₄·H₂O0.01-0.4，K₂HPO₄·3H₂O0.01-2.0，pH5.5-8.0；用营养液调整固体发酵培养基的湿度，使灭菌前固体 发酵培养基湿度在50％以上； 3.2.发酵条件，摇瓶中装入步骤3.1得到的固体发酵培养基10-30g，种 子液的接种量为1％-10％(ml/g)，发酵温度25-45℃，发酵时间24-72小时， 发酵过程中翻动培养物1-3次； 3.3.摇瓶内装入按要求配制的固体发酵培养基，充分混合后用纱布封口， 100℃-121℃灭菌10-40分钟；将步骤2得到的种子液接入已灭菌的含培养基 的摇瓶中，充分混合；置恒温箱中静置培养，恒温箱中保持50％以上的湿度 以防止培养基过度失水；每隔12-24小时翻动培养物，保证菌体在固体基中 生长均匀； 4.γ-PGA的提取和纯化 4.1.提取：收集发酵好的培养物，加入5-20倍的蒸馏水或生理盐水， 充分混合，浸泡后混匀； 4.2.过滤：过滤出浸提液，滤渣再按步骤4.1的方式浸提，过滤出浸提液， 重复2-4次；且合并各次的浸提液； 4.3.离心：将浸提液调整PH至2-8，以5000-15000rpm离心5-80分钟， 收集上层聚谷氨酸溶液； 4.4.超滤：用不同孔径的超滤膜进行超滤，得到不同分子量分布的γ-PGA 溶液； 4.5.有机溶剂沉淀：加入2-5倍的冷乙醇或甲醇等有机溶剂至γ-PGA溶 液中，放置过夜，收集沉淀；有必要时用蒸馏水溶解沉淀，再用有机溶剂沉 淀，经过多次反复后能得到高纯度γ-PGA； 4.6.冷冻干燥：沉淀经过冷冻干燥后密封在干燥器中保存，防止吸水。