两探针实时荧光检测丙型肝炎病毒核糖核酸的方法

摘要

本发明公开了一种两探针实时荧光检测丙型肝炎病毒核糖核酸的方法，包括引物和探针的制备、制备反应液、制备RNA标准品、荧光定量检测等步骤。本发明大大提高了HCVRNA检测的灵敏度低、特异性。

主权项

1、一种两探针实时荧光检测丙型肝炎病毒核糖核酸的方法，其特征是：包括下列步骤：(1)引物和探针的制备：根据HCV全系列，在HCV基因组5’非编码区(5’-UTR)，设计并合成如下序列的引物HCV-S、HCV-AS和探针HCV-P1、HCV-P2：引物HCV-S：5’-AACTACTGTCTTCACGCAGAAAGC-3’(nt52～nt75)引物HCV-AS：5’-CACTCACAAGCGCCCTATCAG-3’(nt312～nt292)探针HCV-P1：5’-ACAGCCTCCAGGCCCCCCC-Fluorescein-3’(nt106～nt124)探针HCV-P1：5′-LC Red 640-CCCGGGAGAGCCATAGTGGTCTG-3′(nt 127～nt149)(2)制备反应液：反应液每份为18μl，每份反应液中含下列组分：1×PCR Buffer，0.2mmol/L dNTPs，5mmol/LMgCl2，引物HCV-S和HCV-AS各0.2μmol/L，HCV-P2探针0.1μmol/L，0.5g/L BSA，AMV10U，DNA聚合酶1U；(3)荧光定量检测：取待测血清100μl，用Trizol法提取HCVRNA，并将提取的HCVRNA、浓度分别为108、107、106、105、104copies/ml的5个标准品各2μl，各加入步骤(2)制得的反应液18μl，分别放入各个反应管中进行处理，同时设空白管和阴性对照；各反应管进行扩增，将含待测样品血清反应管的扩增结果与其他反应管扩增结果比较，得出待测样品血清中丙型肝炎病毒核糖核酸的含量。