一种碱性低温蛋白酶及其制备方法

摘要

一种碱性低温蛋白酶及其制备方法，涉及一种细菌和从细菌得到的蛋白酶。提供一种从南极深海泥样获得并经分离成为纯培养物的菌株海杆菌属R2、从R2菌株得到的碱性低温蛋白酶及其制备方法。保藏编号为CCTCC NO：M205002。其步骤为粗酶液制备：将菌株R2活化后接于培养基，培养至指数生长期，再转接于培养基中，加氨苄青霉素和天冬酰胺，培养，发酵，离心；粗酶液加硫酸铵离心取上清，离心取沉淀，在缓冲液中透析；酶液离心，冷冻干燥，再上样洗脱，收集酶活性部分冷冻干燥；重溶于缓冲液中并透析，上样洗脱，合并活性部分，冷冻干燥；样品溶于缓冲液中并透析分离纯化，收集有活力部分冷冻干燥，即为纯酶。

主权项

1.一种从海杆菌属菌株R2得到的碱性低温蛋白酶的制备方法，海杆菌属(Marinobactersp.)菌株R2已于2005年1月5日保藏于中国武汉的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M205002，其特征在于其步骤为：1)粗酶液制备：将菌株R2用无机盐培养基进行活化后转接于液体酪蛋白培养基中，在5～30℃的条件下振荡培养至指数生长期，将处于指数生长期的菌液转接于液体发酵培养基中，并加入氨苄青霉素，在5～25℃温度下振荡培养，1～4天后加入天冬酰胺，继续振荡培养至培养基中的固体酪蛋白颗粒消失且培养液呈淡乳黄色即为产酶高峰期，将发酵液离心，取上清，得粗酶液，活化菌种时的无机盐培养基选自MM培养基：(NH4)2SO4 0.1％，K2HPO40.7％，KH2PO4 0.3％，柠檬酸钠0.05％，MgSO4 0.01％，葡萄糖0.5％，琼脂1.5％～2.0％，蒸馏水配制，发酵时加入的氨苄青霉素终浓度为0.05％，天冬酰胺的终浓度为0.005％；2)粗酶液加硫酸铵至30％～40％饱和度，离心取上清，继续加硫酸铵至70％～80％饱和度，离心取沉淀，在Tris-HCl缓冲液中透析过夜；3)将透析过后的酶液离心，上清液用冷冻干燥进行浓缩，再上样于已用Tris-HCl缓冲液预平衡过的DEAE-52柱，采用含0～2mol/L NaCl线性梯度的Tris-HCl缓冲液洗脱，收集酶活性部分冷冻干燥；4)把冷冻干燥后的酶粉重溶于Tris-HCl缓冲液中并透析过夜，然后上样于用同一缓冲液平衡的Sephadex G-75柱，并用相同的缓冲液洗脱，合并活性部分，冷冻干燥；5)将冻干后的样品溶于Tris-HCl缓冲液中并透析过夜，再分离纯化，收集有活力部分冷冻干燥，即为纯酶，分离纯化时所用的缓冲液采用0.01mol/L Tris-HCl缓冲液，pH 8.0～9.0，分离纯化采用电泳纯化，电泳纯化的条件为：分离胶浓度14％，柱高5cm，电压300V，浓缩胶浓度为4％，柱高1cm，电压240V。