雪莲体胚一步成苗的方法

摘要

本发明涉及一种雪莲体胚一步成苗的方法，该方法是根据体胚发生原理，通过间接体胚发生方式(即经愈伤阶段形成体胚)得到体胚，实现了雪莲体胚同时生根生芽，一步转化成苗。该方法操作简单，为雪莲大面积人工种植提供了一条新的途径。为雪莲大面积人工种植奠定基础。

主权项

1、一种雪莲体胚一步成苗的方法，其特征在于按下列步骤进行：a、选用雪莲种子，流水冲洗1小时，75％的乙醇消毒50-60s，0.1％的HgCl2溶液消毒15-20min后，接种到MS培养基上，10天后有70％种子萌发，培养基添加蔗糖3％，琼脂0.5％，调节pH5.85±0.5，灭菌条件为121℃，20min，培养条件：室内散射光下光照为8-10h/d，25±1℃，湿度为65±5％；b、将生长20天的无菌苗切成0.5cm2的小段，接种到琼脂固化MS+0.5mg/l 2，4-D+0.05-1mg/l BA的培养基上，培养基添加蔗糖3％，琼脂0.5％，调节pH5.85±0.05，灭菌条件为121℃，20min，固体培养接种量为250ml三角瓶含50ml琼脂固化培养基，接7-8个外植体，培养条件：日光灯2500-5000lx，光照时间12h/d，25±1℃，湿度为65±5％；c、30±5天后，90-95％的外植体诱导出愈伤，培养一个月后，对诱导出的愈伤进行第一次继代，继代培养基：MS+0.05-0.1mg/l2，4-D，固体培养接种量为250ml三角瓶含50ml琼脂固化培养基，接7-8个外植体，培养条件：日光灯2500-5000lx，光照时间12h/d，25±1℃，湿度为65±5％；d、第一次继代20天后，挑选黄绿色，颗粒状，质地紧实的胚性愈伤，转接到250ml，内含50ml液态体胚分化培养基MS+0.05-0.1mg/l 2，4-D的摇瓶中，进行悬浮培养，接种量为3％W/V，10±2天后对摇瓶进行继代，继代培养基为含或不含0.05mg/l 2，4-D的MS培养基，交替继代，灭菌条件：121℃，20min，培养条件：室内散射光下光照为8-10h/d，25±1℃，120r/min；e、继代3-4次后，胚性愈伤表面产生颗粒状的白色突起，继代培养基中除去2，4-D，加入5-25mg/l PEG6000，相同培养基继代两次后，逐渐降低PEG浓度，培养条件：室内散射光下光照为8-10h/d，25±1℃，120r/min；f、待体细胞胚发育到鱼雷形胚阶段，加入0.05-2mg/l GA3，相同培养基继代两次后，逐渐降低GA3浓度，培养条件：室内散射光下光照为8-10h/d，25±1℃，120r/min；g、待体胚发育到子叶形胚，将其转接到琼脂固化培养基MS+5mg/LGA3上，培养基添加蔗糖3％，琼脂0.7％，调节pH5.85±0.05，灭菌时间为121℃，20min，培养条件：日光灯2500-5000lx，光照时间12h/d，25±1℃，湿度为65±5％；h、培养20天，体胚顶端萌发芽，底部生根，再将其转接到壮苗培养基MS+0.05-2mg/l NAA+0.01-0.5mg/l BA上，培养基添加蔗糖3％，琼脂0.5％，调节pH5.85±0.5，灭菌条件为121℃，20min，培养条件：日光灯2500-5000lx，光照时间12h/d，25±1℃，湿度为65±5％，壮苗2-3代后，将再生苗移栽到盛有无菌蛭石的小瓶中炼苗，成活后置于温室生长。