人白介素－2与人血清白蛋白的融合蛋白的制备方法及产品

摘要

人白介素－2(IL－2)与人血清白蛋白(HSA)的融合蛋白的制备方法及产品，属于长效融合蛋白药物技术领域。本发明利用重叠PCR技术，连接IL－2 cDNA和HSA cDNA，中间不加入任何连接肽，得到的IL－2－HSA cDNA融合体在宿主系统进行表达，被整合到宿主的染色体中；本发明的融合蛋白包括与人白介素－2至少85％序列同源的第一区和人血清白蛋白至少85％序列同源的第二区，该融合蛋白可以在不改变融合蛋白特性的前提下，进行个别氨基酸残基的取代、缺失或加入；宿主表达系统可以是细菌、酵母、昆虫细胞、动物细胞、植物细胞等。本发明的融合蛋白在保持了人白介素－2的生理特性的基础上延长其在体内的半衰期，在药学领域有良好的应用前景。

主权项

1、人白介素-2与人血清白蛋白的融合蛋白的制备方法，其特征是通过提取人外周血单核细胞mRNA，然后反转录得到IL-2cDNA，并将IL-2cDNA克隆到pMD19T载体中，PCR从含IL-2cDNA的载体IL-2-pMD19T中直接扩增得到IL-2cDNA；通过PCR从含HSA cDNA质粒中扩增获得HSA cDNA；利用重叠PCR技术，连接IL-2cDNA和HSA cDNA，中间不加入任何连接肽，得到的IL-2-HSA cDNA融合体插入到克隆载体；IL-2-HSA cDNA融合体在宿主系统进行表达，IL-2-HSA cDNA融合体被整合到宿主的染色体中；(1)模板mRNA的提取取用EDTA抗凝的人外周血10mL，在2小时内进行淋巴细胞的分离：将血液小心加入盛有等量淋巴细胞分离液的离心管，注意不要破坏界面；将离心管配平后，放入离心机离心，1000rpm，8分钟；取出离心管，用无菌的移液枪将外周血单核细胞云雾层小心取出，放入另外的洁净试管中；加PBS悬浮，小心振荡数次，800rpm，8分钟，弃上清，加入1640培养基15ml，加青霉素和链霉素均至终浓度为100U/μl；植物血球凝集素梯度加入，分别加0.5ml×2，0.3ml×2，1.0ml×2；放入37℃，5％CO2培养箱中，30～48小时，按照Trizol的说明书提取模板mRNA；(2)IL-2cDNA的反转录和克隆RT体系：模板1μg mRNA溶液10μL；5×Reverse Transcription Buffer 4μL；10mM的dNTP 2μL；20U的RNase Inhibiter0.5μL；50pmol的Oligo(dT)181μL；5U的Amv Rewerse Transcriptase 1μL；DEPC H2O定容至20μL；轻轻搅拌，在PCR仪上进行cDNA的合成：42℃，60min，室温放置10min，冰上放置2min，-80℃超低温冰箱保存备用或者直接使用；以RT-PCR产物为模板，进行如下扩增，引物为：I-1：5′-TGCAACTCCTGTCTTGCATTGCACTAAG-3′I-2：5′-GAAGGCCTGATATGTTTTAAGTGGGAAG-3′50μl的PCR反应体系中加入：10μmol/L的I-1和I-2各2μl，2mmol/L的dNTP5μl，10×Taq Buffer 5μl，5U/μl的Taq DNA聚合酶0.5μl，IL-2cDNA 1μg，加双蒸水补齐50μl，PCR条件为：95℃充分变性5分钟，94℃变性1分钟，57℃退火1分钟，72℃延伸90秒，循环30次；扩增的产物进行T-A克隆到pMD19 T-Vector中；(3)IL-2c DNA的扩增从含有人IL-2cDNA的质粒IL-2-pMD19中用PCR的方法扩增，引物如下：IH-1：5′-GGAATTCAAAAGAGCACCTTACTTCAAGTTCTAC-3′IH-2：5′-ACCTCACTCTTGTGTGCATCAGTCAGTGTTGAGATGATGC-3′PCR方法如下：50μl的反应体系中加入：10μmol/L的引物IH-1和引物IH-2各2.5μl，2mmol/L的dNTP 5μl，10×pfu Buffer 5μl，5U/μl的pfu DNA聚合酶0.5μl，IL-2-pMD19 1μg，加双蒸水补齐50μl，PCR条件为：95℃充分变性5分钟，94℃变性1分钟，57℃退火1分钟，72℃延伸90秒，循环30次；通过琼脂糖凝胶电泳分析反应产物，在加样泳道出现目标条带，用PCR片段胶回收试剂盒纯化出0.4kb的目标条带，纯化好的目标片段备用；(4)HSA cDNA的PCR扩增利用PCR从含有HSA cDNA质粒中扩增出HSA cDNA，所用的引物为：IH-3：5′-GCATCATCTCAACACTGACTGATGCACACAAGAGTGAGGT-3′IH-4：5′-TTGCGGCCGCTTATAAGCCTAAGGCAGCTT-3′50μl的反应体系中加入：10μmol/L的引物IH-3和引物IH-4各2.5μl，2mmol/L的dNTP 5μl，10×pfu Buffer 5μl，5U/μl的pfu DNA聚合酶0.5μl，含有HSAcDNA的质粒pBlue-HSA 1μg，加双蒸水补齐50μl；PCR条件为：95℃充分变性5分钟，94℃变性1分钟，60℃退火1分钟，72℃延伸150秒，循环30次；通过琼脂糖凝胶电泳分析反应产物，在加样泳道出现目标条带，用PCR片段胶回收试剂盒纯化出1.8kb的目标条带，纯化好的目标片段备用；(5)IL-2cDNA和HSA cDNA的连接利用重叠PCR融合IL-2cDNA和HSA cDNA，将IL-2cDNA的PCR扩增产物纯化后和HSAcDNA的PCR扩增产物纯化后按照1∶1的摩尔比混合后作为模板，于50μl的反应体系中加入：2mmol/L的dNTP 5μl，10×Taq Buffer 5μl，5U/μl的Taq DNA聚合酶0.5μl，混合好的模板1μl，加双蒸水补齐45μl；PCR条件为：95℃充分变性5分钟，94℃变性1分钟，60℃退火1分钟，72℃延伸3分钟，循环10次后，向反应体系中加入10μmol/L的IH-1和IH-4的引物各2.5μl，继续做30个上述循环；通过琼脂糖凝胶电泳分析反应产物，在加样泳道出现目标条带，用PCR片段胶回收试剂盒纯化出2.2kb的目标条带，再双酶切并纯化好的目标片段IL-2-HAS和载体pMD19T按照1∶7的摩尔比用T4连接酶连接；连接产物转化大肠杆菌XL-1Blue感受态细胞，转化物涂布于含有X-gal、IPTG和100μg/ml氨苄青霉素的LB琼脂平板，37℃培养过夜；挑取白色菌落，接种于20ml100μg/ml氨苄青霉素的LB培养基中37℃培养过夜，提取质粒；通过PCR和EcoRI和NotI双酶切，琼脂糖凝胶电泳鉴定阳性克隆，并对重组质粒EcoRI和NotI酶切位点间区域进行DNA测序；阳性重组子保存在含有20％甘油的LB中，冻于-80℃；重组质粒命名为pMD19-IL-2-HSA，阳性重组子命名为XL-1-Blue-pMD19-IL-2-HSA；(6)融合蛋白IL-2-HSA的酵母表达系统构建取一支冻存的XL-1Blue-pMD19-IL-2-HSA，接种到20ml含100μg/ml氨苄青霉素的LB培养基中37℃培养过夜，提取质粒，质粒pMD19-IL-2-HSA和酵母表达载体pPIC9K分别经EcoRI和NotI双酶切，琼脂糖凝胶电泳纯化，用PCR片段胶回收试剂盒回收，用T4连接酶连接两双酶切后纯化好的片段；连接产物转化大肠杆菌XL-1Blue感受态细胞，转化物涂布于含有100μg/ml氨苄青霉素的LB琼脂平板，37℃培养过夜；挑取白色菌落，接种于20ml 100μg/ml氨苄青霉素的LB培养基中37℃培养过夜，提取质粒；通过PCR，及EcoRI和NotI双酶切，琼脂糖凝胶电泳鉴定阳性克隆，阳性重组子保存在含有20％甘油的LB中，冻于-80℃。重组质粒命名为pPIC-IL-2-HSA，阳性重组子命名为XL-1Blue-pPIC-IL-2-HSA；提取XL-1Blue-pPIC-IL-2-HSA中的质粒，经SalI酶切后，电击转化毕赤酵母KM71，提取重组毕赤酵母基因组DNA，通过PCR，琼脂糖凝胶电泳鉴定，阳性重组子命名为KM71-pPIC-IL-2-HSA；(7)融合蛋白IL-2-HSA的表达：将KM71-pPIC-IL-2-HSA接种至装有100ml BMGY500ml三角瓶中，250rpm、29℃培养至OD600为2～6，离心收集菌体，将收集到的菌体接种至装有20mlBMMY的100ml三角瓶中，每24小时补加一次甲醇至终浓度0.5％，诱导7天，离心收集上清，过滤除菌，ELISA法测定上清中的融合蛋白IL-2-HSA含量，Western杂交鉴定融合蛋白IL-2-HSA分子的HSA的免疫源性。