利用核糖体操纵子间区探针检测水生动物病原菌的方法

摘要

本发明公开了一种利用核糖体操纵子间区探针组成寡核苷酸微阵列检验多种能够导致水生动物传染病病原菌的方法，其技术原理为分子杂交——酶联免疫显色技术，属于细菌检测技术，其技术方案是用生物信息学方法设计特异性探针，包括设计筛选的34条用作探针的寡核苷酸序列以及与之配套的PCR和杂交反应条件。通过PCR扩增并用地高辛标记细菌16s－23srRNA基因间区序列，并用该PCR产物和一组特异性的寡核苷酸探针杂交，经酶联免疫显色显色后，可以从待测样品中，精确检测出是否存在水生动物传染病病原菌。该方法的优点是，省去了重复的细菌培养筛选环节，节约时间；分子杂交鉴定方法不受培养条件和细菌生理状态的影响，较生理生化鉴定方法更为准确。

主权项

1.一种利用核糖体操纵子间区探针检测水生动物病原菌的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：(1)设计特异性寡核苷酸探针，用于寡核苷酸微阵列检测检测，所设计的特异性寡核苷酸探针序列如下：序列一：星状诺卡氏菌探针Nser2 CGAAGAAGTCTAATTTCGGTA序列二：星状诺卡氏菌探针NSER1 GGCAAACCATCAGAGCATG序列三：巴斯德菌属通用探针PFirc1 TGTTCTTTAAAAAA(T/A)T(G/A)GAAACAAGCTG序列四：多杀巴斯德氏菌探针2 Pmulii 3 AAGCGAAAGCAAAAGAGTGAAGCGA序列五：杀鱼巴斯德氏菌探针1 Pmulii 2 CAATGAAGAGACAAAAAACCGAAATCC序列六：鲴鱼爱德华氏菌探针Eict1 ACCCCGTGTCCCCTTCGTCTAGAGG序列七：鲴鱼爱德华氏菌探针2 Eict2 TTACAGCACGAAGTGAAACACCTTCG序列八：迟缓爱德华氏菌探针1 Etar1 GGTAATAAGGTATTGCAGTAAAGTC序列九：迟缓爱德华氏菌探针2 Etar2 ATGGGGCTATAGCTCAGCTGGGAGA序列十：耶尔森氏菌属通用探针YerFip1 TACAGCTGAAATTTACCCCGCC序列十一：鲁氏耶尔森氏菌探针1 YerFip2 AGATGTACTGTCAGCAATGA(C/T)AAGACA序列十二：气单胞菌属通用探针1 AF&Valgip1GCTGATTTAAAAAGTAGTTCTCAAACATTTGT序列十三：杀鲑气单胞菌探针1 AF&Valgip3 AGCTACCCGGTTACCTGCGCGC序列十四：杀鲑气单胞菌探针2 AsalValipr GCTCGCGCGCAGGTAACCGGGT序列十五：豚鼠气单胞菌探针1 AcavGlip1 GCCGCTAGCCTCGCAGGCTCGG序列十六：豚鼠气单胞菌探针2 AcavGlip2 GCCTTTACGAAAATCATTGCGAA序列十七：温和气单胞菌探针1 Asobculip1 TAATGGCGCTCGGCCTCGCAG序列十八：温和气单胞菌探针2 Asobculip2 CGGCACTCGCCATTACCCAAAA序列十九：鲑鱼肾杆菌探针1 Rsalip1 AGATTCGATGGTTTGGGAGGTTC序列二十：鲑鱼肾杆菌探针2 Rsalip2 GATAACAGGCG(C/A)TCTGCTGATTC序列二十一：产气荚膜梭菌探针1 Cperfip1 AATGAATTCTGGATAATATCTCTGTTTAATTT序列二十二：产气荚膜梭菌探针2 Cperfip2AAGGAATACATCTTAGGAC(A/T)ACTAAGATGA序列二十三：肉毒梭菌探针1 CbotripTAAATAAGAACTATTCATTAATTGTTAAAATTA(G/A)ATT序列二十四：肉毒梭菌探针2 Cbotiip CTTCGAAAAAGAAGGTTTA(A/G)TTTAATGTAG序列二十五：海分支杆菌探针2 Mm2 ATTGGATGCG CTGCCTTTTG GTGGC序列二十六：霍乱弧菌及拟态弧菌探针1 VcmIIp1 GAAAGATAAACACCAACAAC(A/C)CATT序列二十七：霍乱弧菌及拟态弧菌探针2 VcmI3p2 AATTAAACGCGAGACAACTTAGGTTG序列二十八：霍乱弧菌探针1 VchoI2p1 TCCACCATCTTTAAGCGTTTTCG序列二十九：霍乱弧菌探针2 VchoI2p2 TCGCTGAGAATGTTTAAAAATGGTT序列三十：创伤弧菌探针1 VvulI1p1 ACGACCCACCATTACTTCAAGAGTT序列三十一：创伤弧菌探针2 VvulI1p2 GCTCCACCATTCTTGAA(C/T)GCAAT序列三十二：副溶血弧菌探针1Vpar1 TATAAAGTAAAGAGAAGAAGAGTTCCCAAA序列三十三：副溶血弧菌探针2Vpar2 TCCATTAGGAATTAAAACTCAAAATATGGG序列三十四：鳗弧菌探针1 TTTGA(A/C)ACAATGGGCGATTAGCT(2)PCR扩增待测样品中全部原核微生物的23s rRNA基因内的DNA片，同时进行地高辛标记；(3)将寡核苷酸微阵列和地高辛标记的PCR产物进行分子杂交；(4)杂交结果通过酶联免疫显色技术显色；(5)显色结果用肉眼观察，可发现进行杂交的特异性探针位点显色。