饮用水中大肠杆菌快速检测方法

摘要

本发明涉及一种饮用水大肠杆菌的快速检测方法。应用分子生物学中的聚合酶链式反应，用PCR方法检测大肠杆菌，包括以下几个步骤：水样中微生物的收集、微生物基因组DNA的提取、PCR扩增、产物观察。采用上述方法与传统方法相比，时间短，从水样送到实验室开始到检测完毕，大约需要4～5个小时；灵敏度高，可以检测到1～10个大肠杆菌/mL水样。而传统检测方法至少需要48h。

主权项

1、饮用水中大肠杆菌快速检测方法，其特征在于包括以下步骤：(1)水样中微生物的收集及其DNA的提取：采用灭菌后的滤膜或滤器过滤水样，在装有无菌水的EP管中，洗涤滤膜，离心，弃上清液，备用；(2)水样中微生物DNA的提取：A、向EP管中加入TE缓冲液，使之重悬；B、加入SDS和蛋白酶K，混匀，温育45min～1h；C、加入氯仿/异戊醇，混匀，离心，将上清液转入一个新EP管中；D、加入等体积的酚/氯仿/异戊醇，混匀，离心，将上清液转入一个新EP管中；E、加入异丙醇，轻轻混合直到DNA沉淀下来，离心；F、弃上清，沉淀物用乙醇洗涤，晾干；G、将沉淀重溶于TE缓冲液，摇匀；H、用紫外分光光度计测定提取的基因组DNA模板的OD值，计算其DNA浓度，计算方法为：DNAμg/μL浓度＝OD值260nm×样品稀释倍数×50/1000I、将基因组DNA模板做好标记，贮存，备用；(3)PCR扩增；反应引物：上游引物：5’-tgt tca gtg gca aga gtt-3’下游引物：5’-taa tcg ata tac ccg ctc-3’50μL反应体系：10×PCR缓冲液 5μLTag酶 2U/μL 1μLMgCl2 25mM 5μLdNTP 2.5mM 5μLddH2O 29μL上游引物10μM 2μL上游引物10μM 2μL模板DNA 1.5μg/μL 1μL(4)产物观察：A、凝胶的准备：先配置琼脂糖溶液，加热，使其充分溶解，再加入溴化乙锭溶液；B、配置TAE电泳液；C、倒胶：将配置好的琼脂糖溶液倒入胶板中，待其凝固后，放入电泳槽中；D、电泳：将扩增好的PCR产物与缓冲液按比例混合，加入到凝胶加样孔中，同时加入DNA分子量标准，接通电源，设定电压和电流，开始电泳。E、观察；将扩增产物在紫外光下观察，拍摄图片。