制备用于在大肠杆菌和昆虫细胞中表达鸭α－干扰素基因的方法

摘要

本发明涉及制备用于在大肠杆菌和昆虫细胞中表达鸭α－干扰素基因的方法。包括编码鸭α－干扰素的基因的克隆，含鸭α－干扰素基因的原核表达载体和重组昆虫杆状病毒转染载体的构建，用所述含鸭α－干扰素基因的重组原核表达载体转化大肠杆菌和诱导表达，用所述含鸭α－干扰素基因的重组杆状病毒转染昆虫细胞及在昆虫细胞中的表达等。通过本方法制备的产品为研究鸭α－干扰素生物活性及其作用机理提供了基础，也可制备成抗病毒的药物。

主权项

1、制备用于在大肠杆菌和昆虫细胞中表达鸭α-干扰素基因的方法，其特征是：(1)用淋巴细胞分离液分离鸭外周血单核细胞，植物血凝素诱导培养鸭外周血单核细胞，收获诱导培养的细胞，用Trizol试剂提取细胞总RNA；(2)设计扩增鸭α-干扰素基因的特异性引物，如下：上游引物P1 20bp：5′-GCACAACCCAGGATCCACCA-3′，引入BamH I酶切位点；下游引物P2 19bp：5′-GTGCGCGTGTGGGGTACCT-3′；(3)利用RT-PCR技术扩增鸭α-干扰素基因；(4)对鸭α-干扰素基因进行克隆、测序鉴定；(5)利用BamH I、Sal I这两个多克隆位点，将鸭α-干扰素基因定向亚克隆至原核表达载体pET30a和昆虫杆状病毒转移载体pBlueBacHis2A上；(6)重组表达质粒pET30a-DuIFN-α转化大肠杆菌BL21(DE3)plysS；(7)确定原核表达系统中表达鸭α-干扰素的最佳诱导时间和IPTG浓度；(8)鸭α-干扰素在大肠杆菌BL21(DE3)plysS中的诱导表达；(9)重组表达质粒pBlueBacHis2A-DuIFN-α与杆状病毒线性DNA共转染昆虫细胞Sf9细胞株；(10)噬斑分析筛选重组病毒；(11)确定真核表达系统中表达重组鸭α-干扰素的最佳表达时间和感染复数；(12)按最佳表达时间和MOI接种病毒，感染Sf9细胞，在Sf9细胞中表达鸭α-干扰素。