马铃薯病毒病两步法多重RT－PCR固相化检测试剂盒及其检测方法

摘要

本发明涉及两步法双重RT－PCR同步检测马铃薯Y病毒、马铃薯卷叶病毒，三重RT－PCR同步检测马铃薯X病毒、马铃薯A病毒、马铃薯S病毒的方法及检测试剂盒，是专门针对马铃薯产业影响较大的5种马铃薯病毒而建立的一种同步检测2或3种病毒的快速方法，检测时间仅用4h，且灵敏度高、特异性强、稳定可靠。该方法克服了现有对马铃薯病毒病依据症状学的常规诊断方法误判率较高、血清学方法难以检测休眠马铃薯中的病毒及病毒含量较少的韧皮部病毒—马铃薯卷叶病毒等缺点；该方法适用于马铃薯种苗、种薯多种病毒病的早期诊断，对马铃薯种薯质量监测和病毒病预防有着重要的作用。

主权项

1.一种用于田间复合侵染的马铃薯Y病毒(简称PVY)和马铃薯卷叶病毒(简称PLRV)的同步反转录两步法双重RT-PCR固相化试剂盒，由以下各种检测试剂组成：样品病毒RNA提取试剂，病毒RNA反转录固相化试剂，cDNA扩增固相化试剂，无害化PVY和PLRV阳性对照品，健康马铃薯植株阴性对照品；其特征是，所述样品病毒RNA提取试剂是0.4～0.5％曲拉通X-100与0.35～0.45％NaSO3在常温下的混合物；所述无害化PVY和PLRV阳性对照品由如下步骤制得：(1)接种马铃薯Y病毒、马铃薯卷叶病毒于健康马铃薯植株上，(2)提取马铃薯Y病毒和马铃薯卷叶病毒复合侵染后的病毒RNA，(3)设计扩增5种马铃薯病毒的上下游引物，上游引物的特征是5’端带有T7启动子序列，(4)进行双重RT-PCR扩增得PVY、PLRV DNA片段混合物，(5)以PVY、PLRV DNA片段混合物为模板转录得PVY、PLRV RNA片段混合物；所述病毒RNA反转录固相化试剂、cDNA扩增固相化试剂分别是固相化混合物冻干胶珠；其中，病毒RNA反转录固相化试剂由双重RT-PCR同步反转录马铃薯Y病毒和马铃薯卷叶病毒组成，该试剂中含有如下组分：组分 终浓度5x反转录缓冲液 1X，25mM MgCl2 3～5mmol/L，25mM dNTPs 1.0～1.5mmol/L，40U/μL RNA酶抑制剂 5～10Unit/10uL，200U/μL MMLV反转录酶 50～100Unit/10uL，25μM PVY∶PLRV反义引物 0.30～0.50∶0.70～0.90，25ng/μL待测样品或RNA模板 1.0～2.5μL，生物大分子稳定剂 加至10μL，所使用的反义引物为寡核苷酸引物对：5’-ACGTCCAAAATGAGAATGCC-3’5’-TGGTGTTCGGTGATGTGACCT-3’(序号No.2)，和寡核苷酸引物对：5’-CGCGCTAACAGAGTTCAGCC-3’5’-GCAATGGGGGTCCAACTCAT-3；(序号No.3)；cDNA扩增固相化试剂由同步扩增马铃薯Y病毒和马铃薯卷叶病毒cDNA的二重PCR反应组成，该试剂中含有如下组分：组分 终浓度10x PCR缓冲液 1X，25mM MgCl2 2.0～2.5mmol/L，25mM dNTPs 0.4～0.5mmol/L，5U/μL Taq热启动聚合酶 1.5～2.5Unit/25uL，25ng/μl PVY∶PLR即上下游引物对 0.30～0.40∶0.15～0.30，生物大分子稳定剂 加至21μL，所使用的引物为寡核苷酸引物对：5’-ACGTCCAAAATGAGAATGCC-3’5’-TGGTGTTCGGTGATGTGACCT-3’(序号：NO.2)，和寡核苷酸引物对：5’-CGCGCTAACAGAGTTCAGCC-3’5’-GCAATGGGGGTCCAACTCAT-3(序号：NO.3)，反转录合成的cDNA 4μL作为PCR反应的模板。