烟草花叶病毒云南分离物TAS－ELISA检测试剂盒及其制备方法

摘要

本发明公开了一种烟草花叶病毒云南分离物TAS-ELISA检测试剂盒，包括盒体、设在盒体内的酶标板和设在盒体内的用液，盒体内的用液包括阳性对照、阴性对照、酶标抗体、缓冲液和底物，盒体内的用液还包括烟草花叶病毒云南分离物的多克隆抗体、烟草花叶病毒云南分离物的单克隆抗体，所述的烟草花叶病毒云南分离物多克隆抗体和所述的烟草花叶病毒云南分离物单克隆抗体由20～30mg/ml病毒浓度的烟草花叶病毒提取液作为免疫抗原，分别采用免疫注射法、单克隆抗体法制备而成；本发明所述的检测试剂盒检测灵敏度高，检测灵敏度可达到0.01～0.001ng/ml，比间接ELISA和DAS-ELISA检测灵敏度提高100～1000倍。

主权项

1、烟草花叶病毒云南分离物TAS-ELISA检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括盒体、设在盒体内的酶标板和设在盒体内的用液，盒体内的用液包括阳性对照、阴性对照、酶标抗体、缓冲液、底物、烟草花叶病毒多克隆抗体和烟草花叶病毒单克隆抗体；所述的烟草花叶病毒多克隆抗体和所述的烟草花叶病毒单克隆抗体由20～30mg/ml病毒浓度的烟草花叶病毒提取液作为免疫抗原，分别采用免疫家兔和免疫小鼠法制备而成；所述的烟草花叶病毒提取液的制备方法为：病叶剪碎，加抽提缓冲液，病叶与抽提缓冲液的重量体积比为1∶1-3，单位为克/毫升，搅拌充分匀浆，过滤；滤液中加入滤液体积25～30％氯仿，搅拌5～20min，4℃下6000rpm离心5-20min，收集上清；上清液中加入PEG至浓度为6～8％，单位为克/毫升，NaCl终浓度为0.1M，溶解后4℃下放置4h～24h；4℃下离心力为10000g下离心10～30min；沉淀用0.01M PBS在pH7.4～7.5下悬浮；悬浮液中加入PEG至浓度为4～8％，单位为克/毫升，NaCl终浓度为0.1M，溶解后4℃放置4h～24h；4℃下离心力为10000g下离心10～30min；沉淀用0.01M PBS在pH7.4～7.5下悬浮；在4℃、6000rpm离心转速下离心5～20min，取上清液；加入铺有10ml25％蔗糖垫的离心管，于4℃下33000rpm离心2～3h，沉淀用pH7.4～7.5，含0.01MMgCl2的0.02M磷酸钾盐缓冲液悬浮，低速离心，取上清液即为病毒提纯液；所述的抽提缓冲液为0.02M磷酸盐缓冲液，pH为7.4～7.5，含0.1％巯基乙醇；所述的烟草花叶病毒云南分离物多克隆抗体采用免疫家兔制备而成，其制备方法为：选用健康雄性家兔作为免疫动物，将提纯病毒稀释至1mg/ml，作为免疫抗原，4℃保存；然后进行免疫注射程序，将1ml免疫抗原加1ml福氏完全佐剂，充分混合，在家兔背部皮下多点注射，每点0.2ml；一周后，用1ml免疫抗原加1ml福氏完全佐剂，充分混合，在家兔双后足足垫注射，每点1ml；一周后，用1ml免疫抗原耳静脉注射；一周后，用2ml免疫抗原耳静脉注射；7-10天后，心脏全采血，分离血清，加入0.1％NaN3，在-70℃下保存，得烟草花叶病毒云南分离物多克隆抗体；所述的烟草花叶病毒单克隆抗体采用克隆抗体法制备而成，其制备方法为：选用Balb/c小白鼠STU系3月龄雌鼠用作病毒免疫，并取它们的脾细胞作细胞融合，将所述的病毒提纯液稀释至1mg/ml，作为免疫抗原，4℃保存；将提纯病毒液免疫抗原细胞融合，ELISA筛选，克隆，然后进行单克隆抗体亚类鉴定，纯化，真空冷冻干燥得单克隆抗体。