一种棉花原位杂交方法

摘要

本发明涉及一种棉花原位杂交方法，包括制片、制备探针、杂交前预处理、制备杂交液、杂交和检测六个步骤，其中，制片时用2％纤维素酶和0.5％果胶酶在37℃下解离1～2.5小时，探针采用多色标记，杂交前杂交液需在90～97℃变性8～10分钟，杂交时要在80～85℃共变性8～10分钟。本发明所述的棉花原位杂交方法采用多色标记探针，能有效消除背景干扰，提高检测灵敏度和准确性。

主权项

1、一种棉花原位杂交方法，它包括以下步骤：(1)制片：取棉花根尖，预处理，固定，然后用2％纤维素酶和0.5％果胶酶于37℃下解离1～2.5小时，压片，-70℃或液氮冰冻，干燥；(2)制备探针：提取DNA或RNA，纯化，剪切，电泳分离目的片段，用荧光素进行多色标记，制得探针；(3)杂交前预处理：干燥制片，依次用100ug/ml的RNA酶和0.1％～0.01％的胃蛋白酶处理，再用4％多聚甲醛固定，然后依次用70％、90％、100％的乙醇脱水，晾干；(4)制备杂交液：杂交液总体积为20ul：100％去离子甲酰胺 10ul；50％硫酸葡聚糖 4ul；20×标准柠檬酸钠盐 2ul；10％十二烷基磺酸钠 1ul；用不同的荧光素标记的探针 各1ul；不足20ul时用灭菌的去离子水补足；将杂交液混匀，于90～97℃变性8～10分钟，转入冰水中处理10～15分钟。(5)杂交：将杂交液滴于制片上，加塑膜盖片，包装，于80～85℃共变性8～10分钟，转入37℃水浴中杂交过夜。(6)检测：用标准柠檬酸钠盐洗脱，然后加与标记用的荧光素匹配的抗体衬染，用抗荧光衰减剂封片，观察荧光信号，采集并加工杂交图像。