筛选与鉴定治疗免疫耐受相关疾病功能基因SERPINH1的方法

摘要

本发明提供了诊断和治疗免疫耐受相关疾病功能基因SERPINH1的筛选与鉴定方法。通过体外培养建立了制备人免疫耐受树突细胞，SERPINH1基因在免疫耐受树突细胞中的表达明显升高。当SERPINH1基因或靶向这些基因的siRNA转染单核细胞系，将影响其转录因素的激活，细胞因子的产生和共刺激分子的表达；重要的是转染免疫调节细胞树突细胞后能够发挥特有的免疫调节功能，引导免疫耐受。该基因在免疫相关性疾病如抗移植排斥反应、肿瘤、炎症、自身免疫性疾病的治疗方面有着巨大的潜在应用价值。

主权项

1、一种筛选与鉴定治疗免疫耐受相关疾病功能基因SERPINH1的方法，其特征在于包括下述步骤：(1)免疫耐受树突细胞的制备和鉴定1)取小鼠的骨髓细胞，用水溶解去除红细胞后，在1000单位GM-CSF，10％FCSRPMI1640培养基中，37℃温度下培养4天的骨髓起源的树突细胞作为未成熟的树突细胞；2)用生理盐水洗三次未成熟的树突细胞，分别与鼠卵巢癌肿瘤细胞，已照射Co60的鼠卵巢癌细胞或鼠卵巢癌细胞上清液在1000单位GM-CSF，10％FCSRPMI1640培养基中共同培养9天；3)用2μl FITC萤光素标记的CD80抗体(BD PharMingen公司)染鼠卵巢肿瘤细胞与树突细胞，在10％FCSRPMI1640培养基中混和培养9天，然后通过流式细胞仪分离出树突细胞，得肿瘤相关免疫耐受树突细胞；4)观察肿瘤相关免疫耐受树突细胞的形态与结构；5)将肿瘤相关免疫耐受树突细胞用生理盐水洗三次后，分别加2μl FITC萤光素标记的抗CD40、CD80和CD86抗体染色，流式细胞仪分析，分析免疫耐受树突细胞刺激分子的表达；6)用类乳头瘤病毒质粒(VLP)免疫鼠引导的特异性T细胞作为靶细胞，肿瘤相关免疫耐受树突细胞与对照树突细胞在装载类乳头瘤病毒质粒(VLP)后作为刺激细胞；在10％FCSRPMI1640培养基中共同培养48小时，取上清液，通过酶联免疫检测试剂盒分析上清液中的IFN-γ(干扰素γ)含量；(2)免疫耐受树突细胞内免疫耐受基因的筛选1)用Trizol试剂从肿瘤相关性树突细胞提取总RNA；2)用基因芯片对肿瘤相关性树突细胞总RNA进行分析：1、用寡核苷酸和dT作为引物以及SuperScript choice(cDNA合成试剂盒SuperScriptTM Choice System For cDNA Synthesis Kit)合成单股cDNA；2、合成双股cDNA，双股cDNA通过苯酚-氯仿抽提后，利用BioArray RNA high yieldTranscript labeling试剂盒(Inzo Bioche)，通过体外转录产生Biomylated anti-sense cRNA；3、处理过的cRNA在45℃下与Affymetrix基因组基因芯片杂交，用Affymetrix FluidicsStaion400洗染基因芯片除去未杂交的cRNA，然后用streptavidin-PE结合Biotimylated cRNA，再与羊抗-streptavidin Ab孵育；用Hewlett-Packard G2500 GeneArray检测荧光强度，用MicroArray Suite 5.0软件对每个基因芯片进行图像分析；4、采用Agilent Bioanalyzer和“Lab on a chip”(芯片实验室技术)证实所有样本有着类似的rRNA比率；5、根据美国基因库提供生物信息，对在肿瘤相关免疫耐受树突细胞基因芯片分析中明显上调的基因或明显下调的基因；6、通过半定量PCR和定量PCR方法进一步评价SERPINH1基因在肿瘤相关的树突细胞的高水平表达；根据基因库提供生物信息，找出在肿瘤相关免疫耐受树突细胞中明显上调的SERPINH1基因序列如下：atgcgctctc tccttctggg caccttatgc ctcttggccg tggccctggc agccgaggtgaagaaacccc tagaggcggc agcccctggt actgcggaga agctaagttc caaggcgaccacactggcag agcgcagcac aggcctggcc ttcagcctat atcaggcgat ggccaaagaccaggcggtgg agaacatcct cctgtcaccc ttggtggtgg cctcatccct gggtcttgtgtcactgggtg gtaaagccac cacagcgtcg caggcgaagg cagtgctgag cgctgagaagctgcgcgatg aggaggtgca cacggggctg ggtgagctgc tccgctccct cagcaactccactgcgcgca acgtgacctg gaaactgggc agccgcctgt acgggcccag ctccgtgagcttcgccgatg acttcgtgcg cagcagcaag caacactaca actgcgaaca ctccaagatcaacttccgag acaagcgcag cgccctgcag tccatcaacg agtgggcctc gcagaccacggacggcaagc tgcctgaggt caccaaggat gtggagcgca cggatggggc actgcttgtgaacgccatgt tctttaagcc acactgggat gagaggtttc accacaggat ggtggacaaccgtggcttca tggtgacccg ctcctatact gtgggtgtta cgatgatgca ccggacaggcctgtacaact actatgacga cgagaaggag aagctgcaga tggtggagat gcccctggctcacaagctct ccagcctcat catcctcatg ccccaccatg tggagccgct cgagcgcttggagaagctgc tgaccaagga gcagctgaag gcctggatgg gaaagatgca gaagaaggctgtcgccatct ccctgcccaa gggcgtggtg gaggtgaccc atgacctgca gaaacatctggcaggactgg gcctgaccga agccatcgac aagaacaagg cagacctatc gcgcatgtctggcaagaagg acctgtacct ggccagtgtg ttccacgcca ctgccttcga gtgggacaccgagggcaacc cctttgacca agacatctac gggcgcgagg agctgcgcag ccccaagctgttctatgccg accacccctt catcttcctg gtgcgagata atcagagcgg ctccttgctcttcattggcc gcctggtccg gcccaaggga gacaagatgc gagatgagtt gtag设计SERPINH1基因引物：5‘atgcgctctctccttctgggcacc3’和3’caactcatctcgcatcttgtctcc5’；用Invitrogen提供的RT-PCR试剂盒进行分析；用SybrGreen I检测模式通过定量PCR，用TAKARA公司提供的SYBR green I萤光染料测定SERPINH1的转录水平；(3)克隆SERPINH1基因用Trizol试剂从肿瘤相关性树突细胞提取总RNA；用SERPINH1引物：5‘atgcgctctctccttctgggcacc3’和3’caactcatctcgcatcttgtctcc5’，通过Invitrogen公司提供的RT-PCR试剂盒，扩增SERPINH1基因，并且通过Invitrogen胶提取试剂盒提取扩增的SERPINH1基因片段；然后通过Invitrogen公司提供的pCDNA3.1 His/V5 ToPo载体，将SERPINH1基因克隆到pCDNA3.1 His/V5 ToPo载体，测序确定出上述列出的SERPINH1序列；(4)对筛选的肿瘤相关免疫耐受相关基因功能进一步鉴定1)、用载有免疫耐受基因SERPINH1载体(Invitrogen公司提供的pCDNA3.1 His/V5 ToPo载体)与pNF-KappaB-Seap报告基因(CloneTech公司)通过lipofectin2000(Invitrogen)共同转染RAW264.7细胞，然后用1μg/mlLPS或25μg/ml PolyI:C刺激，24小时后吸取上清液，上清液用clonetech公司提供的“Great Esc Ape SEAP Chemilumine Scence”检测试剂盒，分析上清液的化学发光强度；2)、肿瘤相关免疫耐受基因SERPINH1转染的RAW264.7，在600μg/ml G418选择条件下，建立稳定转染的细胞系(免疫耐受基因SERPINH1转染的RAW264.7)，染色后通过流式细胞仪分析这些稳定转染的细胞表面刺激分子CD40、CD80和CD86及其它共刺激分子的表达，分析这些稳定转染的细胞在不同的Toll-like受体连接键(1μg/ml LPS，25μg/ml Poly I:C 50μg/ml PGN和100nM B.DNA)的刺激后48小时细胞表面CD40、CD80、CD86和其它表面分子共刺激分子的表达；3)、SERPINH1稳定转染的RAW264.7细胞系的总RNA再按照Invitrogen公司提供的方法与步骤，用Trizol试剂提取RNA，总RNA用于基因芯片分析SERPINH1对细胞因子、化学趋化因子及细胞内信号系统的表达的影响；4)、沉寂SERPINH1基因对肿瘤相关免疫耐受树突细胞引导T调节细胞CD4+CD25+细胞的影响，应用AMAXA公司提供的siRNA树突细胞转染试剂盒进行转染，靶向免疫耐受基因SERPINH1的siRNA转染的卵巢肿瘤相关免疫耐受树突细胞与鼠脾Native T细胞共同培养10天后，在10％FCSRPMI1640培养基中培养，培养温度37℃；流式细胞仪分析CD4+CD25+T调节细胞的比例：SERPINH1靶序列1#：AACACTACAACTGCGAACACT；siRNA序列：sense strand siRNA：CACUACAACUGCGAACACUtt和antisense strandsiRNA：AGUGUUCGCAGUUGUAGUGtt；SERPINH1靶序列2#：AACTACTATGACGACGAGAAG；siRNA序列：sense strand siRNA：CUACUAUGACGACGAGAAGtt和antisense strandsiRNA：CUUCUCGUCGUCAUAGUAGtt；对照siRNA：上述siRNA的人工突变形式(ΔsiRNA)：siRNA序列：sense strand siRNA：CAGUACCACUGCGAACACUtt和antisense strand siRNA：AGUGUUCGCAGUGGUACUGtt；用德国生产的Nucleofector核酸转染仪(AMAXA公司)将siRNA转染至树突细胞；评价对树突细胞的影响；5)、沉寂SERPINH1基因对树突细胞抗原呈递功能的影响，靶向免疫耐受基因SERPINH1的siRNA转染的卵巢肿瘤相关免疫耐受树突细胞，装载类乳头瘤病毒质粒后刺激类乳头瘤病毒颗粒特异的T细胞反应，通过ELISA试剂盒测定上清液干扰素γ(IFN-γ)的浓度，6)、沉寂SERPINH1基因对树突细胞抵抗肿瘤对树突细胞的影响，用SBI SystemBiosciences公司提供的Double-Promoter pFIV-H1/U6 siRNA克隆和表达质粒，按照该公司提供的实验步骤组建了靶向SERPINH1基因的慢病毒感染系统，siRNA模版的设计和插入按照SBI System Biosciences公司提供的方法和步骤进行；SERPINH1siRNA模版1#：5’cacaagctct ccagcctcat catc-3’和3’gtgttcgagaggtcggagtagtag-5’；SERPINH1siRNA模版2#：5’-ctgcgcgatgaggaggtgcacacg-3’和3’gacgcgctactcctccacgtgtgc-5’；对照siRNA模版：上述siRNA模版的突变形式(ΔsiRNA)：cacacgctct ccagcctcat cagc-3’和3’gtgtgcgagaggtcggagtagtcg-5’。利用携带靶向SERPINH1基因siRNA慢病毒转染树突细胞，同时设靶向SERPINH1基因siRNA的慢病毒对照，用慢病毒转染树突细胞，得到不同转染的树突细胞与卵巢癌细胞在10％FCS1640培养基中37℃共同培养，一周后，观察树突细胞的形态、结构和抗原刺激分子和进行抗原呈递功能分析以决定抗原呈递功能。