鱼类基因原位修饰育种的方法

摘要

本发明提供一种鱼类基因育种的方法，旨在提供一种利用同源重组来进行鱼类基因原位修饰育种的方法。该鱼类基因原位修饰育种的方法是按下述步骤进行的：(1)分离鱼的特定基因(如生长激素基因/肌动蛋白基因等)侧翼序列/启动调控序列DNA片段，构建以肌动蛋白基因启动调控序列置换生长激素基因启动调控序列的同源重组载体；(2)将上述同源重组载体显微注射到斑马鱼胚胎，筛选阳性同源重组置换鱼苗；(3)分析内源基因修饰鱼类的相关基因表达水平和遗传表型。本发明可用于鱼类育种。

主权项

1、一种鱼类基因原位修饰育种的方法，其特征在于，它包括下述步骤：1)分离鱼的β-肌动蛋白基因启动调控序列、生长激素基因启动调控序列及其侧翼序列；2)以鱼的基因中的所述生长激素基因启动调控序列作为同源重组的靶DNA片段；3)通过同源重组将所述β-肌动蛋白基因启动调控序列替代所述生长激素基因启动调控序列；4)构建同源重组载体：A)所述同源重组载体包括生长激素启动调控序列5′侧翼序列、生长激素启动调控序列3′侧翼序列、β-肌动蛋白基因启动调控序列、绿色荧光蛋白正向标记基因及两个同向的Cre/loxP序列、红色荧光蛋白负向标记基因；B)所述生长激素启动调控序列5′侧翼序列作为同源长臂，所述生长激素启动调控序列3′侧翼序列作为同源短臂；C)将所述两个同向的Cre/loxP序列分别置于所述绿色荧光蛋白正向标记基因的两侧，然后将所述绿色荧光蛋白正向标记基因置于所述同源长臂与所述同源短臂的内侧；D)将所述红色荧光蛋白负向标记基因置于所述同源长臂与所述同源短臂的外侧；E)经限制性内切酶消化，得到线性重组DNA片段；5)鱼进行人工授精后，在第一次卵裂前，采用显微注射方法，将所述同源重组载体导入受精卵，随后受精卵在实验室26℃～30℃的无菌环境中孵化；6)在荧光解剖镜下筛选仅出现绿色荧光的胚胎，获得同源重组的嵌合体；7)PCR法和Southern杂交法检测确认发生同源重组的细胞或胚胎。