人β干扰素与人血清白蛋白的融合蛋白的制备方法及产品

摘要

人β干扰素与人血清白蛋白的融合蛋白的制备方法及产品，属于长效融合蛋白药物技术领域。本发明利用重叠PCR技术，连接IFNβcDNA和HSA cDNA，中间不加入任何连接肽，得到的IFNβ－HSA cDNA融合基因被整合到宿主的染色体中进行表达；本发明的融合蛋白包括与人β干扰素至少85％序列同源的第一区和与人血清白蛋白至少85％序列同源的第二区，两区直接连接，中间不加入任何连接肽，该融合蛋白可以在不改变融合蛋白特性的前提下，进行个别氨基酸残基的取代、缺失或加入；宿主表达系统可以是细菌、酵母、昆虫细胞、动物细胞、植物细胞等。本发明的融合蛋白在保持了人β干扰素的生理特性的基础上延长其在体内的半衰期，在药学领域有良好的应用前景。

主权项

1、人β干扰素与人血清白蛋白的融合蛋白的制备方法，其特征是从人外周血白细胞中提取人基因组DNA，通过PCR从人基因组DNA中直接扩增得到IFNβcDNA；通过PCR从人胎肝cDNA文库中扩增获得HSA cDNA；利用重叠PCR技术，连接IFNβcDNA和HSA cDNA，中间不加入任何连接肽，得到的IFNβ-HSA cDNA融合基因插入到克隆载体中保存；利用毕赤酵母分泌型表达载体将IFNβ-HSA cDNA融合基因整合到宿主的染色体中进行表达；(1)IFNβcDNA的克隆：从健康人外周血白细胞中的基因组DNA，用限制性内切酶EcoRI或HindIII消化提取得到的基因组DNA，通过PCR扩增出IFNβcDNA，所用的引物如下：Pb1：5’-TAGTCGACATGAGCTACAACTTGCTTGG-3’Pb2：5’-AGAAGCTTTCAGTTTCGGAGGTAACCTG-3’PCR方法如下：50μl的反应体系中加入：10μmol/L的Pb1和Pb2的引物各3μl，2mmol/L的dNTP 5μl，10×pfu Buffer 1μl，5U/μl的pfu DNA聚合酶0.5μl，经限制性内切酶EcoRI或HindIII消化提取得到的基因组DNA 1μg，加双蒸水补齐50μl，PCR条件为：95℃变性5分钟，94℃变性1分钟，57℃退火1分钟，72℃延伸90秒，循环30次；通琼脂糖凝胶电泳分析反应产物，在加样泳道出现目标条带，用PCR片段胶回收试剂盒纯化出0.5kb的目标片段，纯化好的目标片段和载体pBlueScript IIKS(+)分别经SalI和HindIII双酶切；琼脂糖凝胶电泳纯化，用PCR片段胶回收试剂盒回收，用T4连接酶连接两双酶切后纯化好的片段；连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，转化物涂布于含有X-gal、IPTG和100μg/ml氨苄青霉素的LB琼脂平板，37℃培养过夜；挑取白色菌落，接种于20ml含100μg/ml氨苄青霉素的LB培养基中37℃培养过夜，提取质粒；通过PCR，及SalI和HindIII双酶切，琼脂糖凝胶电泳鉴定阳性克隆，并对重组质粒SalI和HindIII酶切位点间区域进行DNA测序；阳性重组子保存在含有20％甘油的LB中，冻于-80℃；重组质粒命名为pBlue-IFNβ，阳性重组子命名为DH5α/pBlue-IFNβ；(2)HSA cDNA的克隆：利用PCR从人胎肝cDNA文库中扩增出HSA cDNA，所用的引物为：HSA1：5’-AGAGTCGACGATGCACACAAGAGTGAGGTTGCTC-3’HSA2：5’-GCCAAGCTTTTATAAGCCTAAGGCAGCTTGACTT-3’PCR方法如下：50μl的反应体系中加入：10μmol/L的HSAl和HSA2的引物各3μl，2mmol/L的dNTP 5μl，10×pfu Buffer 1μl，5U/μl的pfu DNA聚合酶0.5μl，人胎肝cDNA文库1μg，加双蒸水补齐50μl；PCR条件为：95℃变性5分钟，94℃变性1分钟，60℃退火1分钟，72℃延伸90秒，循环30次；通琼脂糖凝胶电泳分析反应产物，在加样泳道出现目标条带，用PCR片段胶回收试剂盒纯化出1.8kb的目标片段，纯化好的目标片段和载体pBlueScript IIKS(+)分别经SalI和HindIII双酶切；琼脂糖凝胶电泳纯化，用PCR片段胶回收试剂盒回收，用T4连接酶连接两双酶切后纯化好的片段；连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，转化物涂布于含有X-gal、IPTG和100μg/ml氨苄青霉素的LB琼脂平板，37℃培养过夜；挑取白色菌落，接种于20ml含100μg/ml氨苄青霉素的LB培养基中37℃培养过夜，提取质粒；通过PCR，及SalI和HindIII双酶切，琼脂糖凝胶电泳鉴定阳性克隆，并对重组质粒SalI和HindIII酶切位点间区域进行DNA测序；阳性重组子保存在含有20％甘油的LB中，冻于-80℃；重组质粒命名为pBlue-HSA，阳性重组子命名为DH5α/pBlue-HSA；(3)IFNβcDNA和HSA cDNA融合基因的克隆：IFNβcDNA的PCR扩增：所用引物如下：Pf1：5’-CCCTCCGAATTCAAAAGAATGAGCTACAACTTGCTTGGA-3’Pf2：5’-ACCTCACTCTTGTGTGCATCGTTTCGGAGGTAACCTGTAA-3’PCR方法如下：50μl的反应体系中加入：10μmol/L的Pf1和Pf2的引物各2.5μl，2mmol/L的dNTP 5μl，10×pfu Buffer 1μl，5U/μl的pfu DNA聚合酶0.5μl，pBlue-IFNβ1ng，加双蒸水补齐50μl；PCR条件为：95℃变性5分钟，65℃退火1分钟，72℃延伸90秒，94℃变性1分钟，循环30次；HSAcDNA的PCR扩增，所用引物如下：Pf3：5’-TTACAGGTTACCTCCGAAACGATGCACACAAGAGTGAGGTT-3’Pf4：5’-CATAAGGCGGCCGCTTATTATAAGCCTAAGGCAGCTTGA-3’PCR方法如下：50μl的反应体系中加入：10μmol/L的引物Pf3和Pf4各2.5μl，2mmol/L的dNTP 5μl，10×pfu Buffer 1μl，5U/μl的pfu DNA聚合酶0.5μl，pBlue-HSA 1ng，加双蒸水补齐50μl；PCR条件为：95℃变性5分钟，65℃退火1分钟，72℃延伸4分钟，94℃变性1分钟，循环30次；利用重叠PCR融合IFNβcDNA和HSA cDNA：将IFNβ的PCR扩增产物和HSA的PCR扩增产物分别稀释40倍，再以1∶1比例混合后作为模板，于50μl的反应体系中加入：2mmol/L的dNTP 5μl，10×pfuBuffer 1μl，5U/μl的pfu DNA聚合酶0.5μl，混合好的模板1μl，加双蒸水补齐45μl；PCR条件为：95℃变性5分钟，65℃退火1分钟，72℃延伸4分钟，94℃变性1分钟，循环10次后，向反应体系中加入10μmol/L的Pf1和Pf4的引物各2.5μl，继续做30次上述循环；通琼脂糖凝胶电泳分析反应产物，在加样泳道出现目标条带，用PCR片段胶回收试剂盒纯化出2.2kb的目标片段，纯化好的目标片段和载体pBlueScript IIKS(+)分别经EcoRI和NotIII双酶切；琼脂糖凝胶电泳纯化，用PCR片段胶回收试剂盒回收，用T4连接酶连接两双酶切后纯化好的片段；连接产物转化大肠杆菌XL-1blue感受态细胞，转化物涂布于含有X-gal、IPTG和100μg/ml氨苄青霉素的LB琼脂平板，37℃培养过夜；挑取白色菌落，接种于20ml含100μg/ml氨苄青霉素的LB培养基中37℃培养过夜，提取质粒；通过PCR，及EcoRI和NotIII双酶切，琼脂糖凝胶电泳鉴定阳性克隆，并对重组质粒EcoRI和NotIII酶切位点间区域进行DNA测序；阳性重组子保存在含有20％甘油的LB中，冻于-80℃；重组质粒命名为pBlue-IFNβ-HSA，阳性重组子命名为XL-1/pBlue-IFNβ-HSA；(4)融合蛋白IFNβ-HSA的酵母表达系统构建：取一支冻存的XL-1/pBlue-IFNβ-HSA，接种到20ml含100μg/ml氨苄青霉素的LB培养基中37℃培养过夜，提取质粒，质粒pBlue-IFNβ-HSA和酵母表达载体pPIC9K，分别经EcoRI和NotI双酶切，琼脂糖凝胶电泳纯化，用PCR片段胶回收试剂盒回收，用T4连接酶连接两双酶切后纯化好的片段；连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，转化物涂布于含100μg/ml氨苄青霉素的LB琼脂平板，37℃培养过夜；挑取白色菌落，接种于20ml含100μg/ml氨苄青霉素的LB培养基中37℃培养过夜，提取质粒；通过PCR，及EcoRI和NotI双酶切，琼脂糖凝胶电泳鉴定阳性克隆，阳性重组子保存在含有20％甘油的LB中，冻于-80℃；重组质粒命名为pPIC-IFNβ-HSA，阳性重组子命名为DH5α/pPIC-IFNβ-HSA；提取DH5α/pPIC-IFNβ-HSA中的质粒，经SalI酶切后，电击转化毕赤酵母KM71，提取重组毕赤酵母基因组DNA，通过PCR，琼脂糖凝胶电泳鉴定，阳性重组子命名为KM71/pPIC-IFNβ-HSA；(5)融合蛋白IFNβ-HSA的表达：将KM71/pPIC-IFNβ-HAS接种至装有100ml BMGY的500ml三角瓶中，300rpm，29℃培养至A600nm为2～6，离心收集菌体，将收集到的菌体接种至装有20mlBMMY的100ml三角瓶中，每24小时补加一次甲醇至终浓度0.5％，诱导7天，离心收集上清，过滤除菌，用细胞病变抑制法测定上清中的融合蛋白IFNβ-HSA活性，Western杂交鉴定融合蛋白IFNβ-HSA分子的HSA的免疫源性。